球孢白僵菌分离株次生代谢产物对番茄枯萎病菌的抗真菌活性研究
研究背景：本文研究了球孢白僵菌分离株Bb758的次生代谢产物对番茄枯萎病菌的抗真菌活性。通过LC-HRMS代谢组学分析，发现其粗提物富含肽类化合物，包括白僵菌素（BEA）和多种2,5-二酮哌嗪（DKP），如环(L-Phe-L-Pro)（CFP）。经柱层析和HPLC纯化后，评估了这些化合物对Fol分生孢子萌发和芽管形成的抑制作用。研究显示，BEA仅在100 μg/mL高浓度下表现出有限的抑菌活性，呈剂量依赖性。相比之下，CFP在低至10 μg/mL（约40.9 μM）即可显著抑制孢子萌发和芽管伸长，100–150 μg/mL时几乎完全阻止萌发。按摩尔浓度比较，CFP的抑菌效力约为BEA的三倍。含CFP的组分D3活性最强，表明DKP混合物可能存在协同效应。显微观察显示，CFP在低浓度下表现为抑菌作用（缩短芽管而非杀死孢子），高浓度则导致萌发彻底失败。研究认为，Fol近缘种本身能产生BEA，可能已演化出耐受机制；而CFP的环状两亲结构易于干扰真菌细胞膜功能，且比线性肽更稳定，具备规模化发酵生产的潜力。尽管Bb758菌株因产BEA毒素不宜直接用于田间，但CFP作为单一活性分子更适合开发成新型生物农药。CFP是一种优于BEA的、靶向Fol早期侵染阶段的抗真菌候选分子，真菌源DKPs可作为可持续作物保护的重要代谢工具，但仍需温室和田间试验进一步验证。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
Fol新鲜分生孢子用芽管诱导培养基重悬至每毫升1×10⁶个，与待测CFP、BEA或各馏分溶液按一比一混合，加入标准96孔板。每个处理条件设置三个重复孔，每孔至少追踪500个单孢子，另设DMSO阴性对照。将培养板置于oCelloScope内，在孵育箱中连续培养。先静置15分钟让孢子沉降贴底，随后每隔30分钟自动扫描一次，总时长15小时。配套UniExplorer软件版本11.1.0.8756调用内置的microconidia算法，对每孔图像进行分割与对象识别，提取单个孢子及芽管的覆盖面积，归一化后得到随时间变化的真菌生物量曲线，同时输出萌发率、芽管形态参数等数据。 Biosense微生物生长动态监测系统通过15小时内的连续曲线区分CFP在不同浓度下的作用模式，包括延迟萌发、缩短芽管等静态抑菌效果以及完全阻断发芽的效果，并确定了显著起效浓度范围。Biosense微生物生长动态监测系统在该研究中承担了动态表型引擎的角色，将化学分离得到的单体及馏分转化为可统计的萌发动力学与形态学参数，是连接代谢物鉴定与核心结论的关键实验技术。
实验结论
结果表明，白僵菌Bb758菌株能产生多种化学结构多样的次级代谢产物，对番茄尖孢镰刀菌具有抗真菌活性。在鉴定出的化合物中，环状(L-苯丙氨酸-L-脯（cyclo(L-Phe-L-Pro)）在实验条件下对分生孢子萌发和芽管发育的抑制作用强于白僵菌。值得注意的是，cyclo(L-Phe-L-Pro) 抑制分生孢子萌发的能力——这是病原体侵染周期中最关键且决定性的阶段——凸显了其在阻断病原体早期定殖过程中的功能重要性。这些发现支持 cyclo(L-Phe-L-Pro) 作为靶向尖孢镰刀菌早期侵染阶段的抗真菌分子的潜力，并进一步强调了二肽类化合物（DKPs）作为基于代谢物的可持续作物保护工具的广泛意义，同时也突显了其前景以及在活体和田间条件下仍需进一步验证的必要性。
图1、Bb758代谢物的化学分类。基于NPClassifier框架对Bb758粗提物和各馏分中推定鉴定的代谢物进行分类。外圈代表生物合成途径，内圈代表相应的化学类别。数值表示各途径或类别中注释代谢物的百分比。
图2、 Bb758馏分对尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发的影响。通过监测600纳米处光密度，在含有不同Bb758馏分各100微克每毫升的萌发培养基中，于9小时内测量Fol微分生孢子的生长情况。数据来自两次独立实验，表示为平均值±标准差。统计学显著性通过双因素方差分析确定。不同字母表示根据Tukey多重比较检验存在统计学显著差异，p值小于0.001。独立实验次数为2，每次设四个重复。
图3、白僵菌素对尖孢镰刀菌番茄专化型的抗真菌活性。图中显示了添加了商业标准品BEA不同浓度10、50和100微克每毫升以及Bb758馏分B4和B5各100微克每毫升的萌发培养基中，Fol微分生孢子在600纳米处的光密度变化。对照组为Fol微分生孢子在萌发培养基中的生长情况。每30分钟进行一次测量，持续9小时。数据表示为平均值±标准差。统计学显著性通过双因素方差分析确定。不同字母表示根据Tukey多重比较检验存在统计学显著差异，p值小于0.001。独立实验次数为2，每次设四个重复。
图4、 环(L-Phe-L-Pro)对尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发和芽管形成的影响。A图为添加了不同浓度商业CFP的萌发培养基中，Fol微分生孢子在600纳米处的光密度变化。CFP150表示150微克每毫升，对应614.02微摩尔；CFP100表示100微克每毫升，对应409.35微摩尔；CFP50表示50微克每毫升，对应204.67微摩尔；CFP10表示10微克每毫升，对应40.93微摩尔。对照组为Fol微分生孢子在萌发培养基中的生长情况。每30分钟进行一次测量，持续9小时。B图展示了各处理的曲线下面积，图总结了每个测试条件的曲线下面积。C图显示了Fol分生孢子萌发的抑制率，计算公式为对照组光密度减去处理组光密度再除以对照组光密度乘以百分之百。D图为芽管形成分析，显示在所有测试浓度10至150微克每毫升下均观察到芽管形成抑制。每30分钟进行一次测量，持续15小时。B图和C图的数据表示为平均值±标准差。统计学显著性通过单因素方差分析确定。不同字母表示根据Tukey多重比较检验存在统计学显著差异，p值小于0.05。独立实验次数为2，每次设四个重复。A图和D图的数据表示为平均值±标准差。统计学显著性通过双因素方差分析确定。不同字母表示根据Tukey多重比较检验存在统计学显著差异，p值小于0.001。E图为代表性显微镜图像，展示了整个浓度范围内萌发逐步受到抑制的过程。比例尺为100微米。
图5、馏分D3与CFP标准品的抗真菌活性比较。图中显示了添加了馏分D3各100微克每毫升以及不同浓度商业CFP标准品10、50、100和150微克每毫升的萌发培养基中，Fol微分生孢子在600纳米处的光密度变化。对照组为Fol微分生孢子在萌发培养基中的生长情况。数据来自两次独立实验，表示为平均值±标准差。统计学显著性通过单因素方差分析确定。不同字母表示根据Tukey多重比较检验存在统计学显著差异，p值小于0.05。独立实验次数为2，每次设四个重复。
总结
尖孢镰刀菌番茄专化型是一种破坏性的土传病原菌，在集约化农业系统中杀菌剂使用日益受限的背景下，该病原菌导致了全球番茄生产的重大损失。化学杀菌剂的可持续替代方案亟需开发，微生物次生代谢产物代表了抗真菌化合物的一类有前景的来源。本研究探讨了一株天然分离的球孢白僵菌Bb758所产生的次生代谢产物的抗真菌潜力，该菌株此前已被报道对尖孢镰刀菌番茄专化型具有较强的生防活性。液相色谱-高分辨质谱代谢组学分析揭示了一个化学多样性的代谢物图谱，其中以氨基酸衍生化合物、肽类和生物碱类为主。通过柱层析和反相高效液相色谱对粗提物进行纯化，分离得到白僵菌素和若干2,5-二酮哌嗪作为主要生物活性成分。这些化合物通过核磁共振和液相色谱-高分辨质谱分析进行了鉴定。研究评估了白僵菌素、环(L-Phe-L-Pro)及各馏分对尖孢镰刀菌番茄专化型分生孢子萌发和芽管发育的抗真菌活性。白僵菌素表现出剂量依赖性但有限的活性，仅在高浓度100微克每毫升时才显示出显著抑制效果。相比之下，环(L-Phe-L-Pro)表现出显著高于白僵菌素的抗真菌活性，在低至10微克每毫升的浓度下即可抑制萌发和芽管形成。这些结果将环(L-Phe-L-Pro)确定为一种有前景的抗真菌化合物，靶向尖孢镰刀菌番茄专化型的早期侵染阶段，并突显了真菌来源的二酮哌嗪类化合物作为可持续病害管理策略候选分子的潜力。oCelloScope自动化活细胞成像系统被用于替代传统人工镜检，对番茄枯萎病菌分生孢子的萌发与芽管发育进行高通量、时间序列的定量评价。oCelloScope在该论文研究中承担了动态表型引擎的角色，将化学分离得到的单体及馏分转化为可统计的萌发动力学与形态学参数，是连接代谢物鉴定与核心结论的关键实验技术。
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