基于 BCA 图像算法的活细胞生长曲线分析：DNMT1 在胆管癌 QBC-939 细胞中的功能验证
【摘要】 目的 探讨 DNA 甲基转移酶 1（DNMT1）真核表达质粒转染对人胆管癌细胞 QBC-939 中 DNMT1 mRNA 表达及细胞增殖的影响。方法 将重组人 DNMT1 正义真核表达质粒 pCMV-HMT、反义质粒 pCMV-THM 及空载体 pCMV 分别通过 Lipofectamine 2000™ 转染 QBC-939 细胞，G418 筛选稳定转染株。半定量 RT-PCR 检测各组 DNMT1 mRNA 相对表达水平；采用丹麦 BioSense 公司 oCelloScope 活细胞生长动态监测系统连续 7 d 实时监测细胞增殖，以背景校正吸收（BCA）值绘制生长动力学曲线。结果 pCMV-HMT 组 DNMT1 mRNA 相对表达量为 0.9362，高于空载体组（0.6865）和空白对照组（0.6913）；pCMV-THM 组降至 0.2321。oCelloScope 监测显示 pCMV-HMT 组 BCA 曲线上升最快、平台期生物量最高；pCMV-THM 组增殖最慢；空载体组与空白对照组曲线基本重叠。结论 上调 DNMT1 可促进胆管癌细胞增殖，而下调 DNMT1 可抑制其增殖；oCelloScope 系统可无标记、实时、准确地评价肿瘤细胞增殖行为。
1 材料与方法
1.1 主要材料
重组人 DNMT1 真核表达质粒（正义质粒 pCMV-HMT、反义质粒 pCMV-THM）由美国 NCI 构建，上海第二医科大学厉静远教授惠赠。人胆管癌细胞系 QBC-939 由第三军医大学王曙光教授惠赠。Lipofectamine 2000™ 购自 Invitrogen 公司；G418 购自 Gibco 公司。TRIzol 试剂、反转录试剂盒、PCR 预混液均购自 TaKaRa 公司。oCelloScope 活细胞生长动态监测系统（丹麦 BioSense 公司）由本实验室共享平台提供。
1.2 细胞培养与转染
QBC-939 细胞常规培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基（37 ℃、5% CO₂ 饱和湿度）。取 pCMV-HMT、pCMV-THM、pCMV 空质粒各 2 μg，按 Lipofectamine 2000™ 说明书操作进行转染，同时设未转染空白对照组。转染 72 h 后加入 800 μg/ml G418 筛选 14 d，待阳性克隆出现后降为 200 μg/ml 维持培养。
1.3 半定量 RT-PCR
收集各组稳定转染细胞，TRIzol 法提取总 RNA，紫外分光光度计测定纯度及浓度。取 1 μg 总 RNA 反转录合成 cDNA，再以 2 μl cDNA 为模板进行 PCR 扩增。DNMT1 引物：上游 5′‑TGACGAGGACGAAGATGG‑3′，下游 5′‑CAGGTGACCGTCTTACAG‑3′，产物 442 bp；β‑actin 内参引物：上游 5′‑TCTACAATGAGCTGCGTGTG‑3′，下游 5′‑ATCTCCTTCTGCATCCTGTC‑3′，产物 682 bp。扩增产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，ImageJ 软件分析各条带灰度值，以 DNMT1/β‑actin 比值表示 mRNA 相对表达水平。
1.4 oCelloScope 活细胞生长动态监测
将各组细胞以 3×10³/孔（200 μl）接种于 96 孔板，每组 3 个复孔。接种后将 96 孔板置于 oCelloScope 系统样品仓内，整体放入 37 ℃、5% CO₂ 培养箱。通过 UniExplorer 软件设置 FluidScope 倾斜光学 Z 轴堆叠扫描模式，扫描间隔 24 h，连续监测 7 d。采用背景校正吸收（Background Corrected Absorption，BCA）算法对明场时序图像进行像素分割，以 BCA 值（log₁₀∑对象像素强度）表征活细胞群体积累量，系统自动输出各组长程生长动力学曲线。
1.5 统计学处理
计量数据以s表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P < 0.05 为差异有统计学意义。所有实验重复 3 次。
2 结 果
2.1 DNMT1 mRNA 表达水平
半定量 RT-PCR 结果显示：pCMV-HMT 组 DNMT1 mRNA 相对表达量为 0.9362，显著高于空载体组（0.6865）和空白对照组（0.6913）（P < 0.01）；pCMV-THM 组降至 0.2321，显著低于其他各组（P < 0.01）；空载体组与空白对照组间差异无统计学意义（P > 0.05）。表明正义 DNMT1 质粒成功上调靶基因 mRNA 水平，反义质粒有效下调之（图 1）。
图 1 各组 QBC-939 细胞 DNMT1 mRNA 表达水平
M：DNA marker；1：空白对照组；2：pCMV 空载体组；3：pCMV-THM 反义组；4：pCMV-HMT 正义组
2.2 细胞增殖动力学曲线
oCelloScope 连续 7 d 实时监测显示（图 2）：pCMV-HMT 组 BCA 值自第 2 天起即快速升高，第 5～7 天达平台期且峰值最高；pCMV-THM 组 BCA 值全程处于低水平，对数期延迟、平台期生物量最小；空载体组与空白对照组 BCA 曲线几乎完全重合，增殖动力学特征一致。各组曲线趋势与 DNMT1 mRNA 表达水平呈正相关，提示 DNMT1 过表达加速胆管癌细胞增殖，而抑制其表达可延缓增殖。
图 2 oCelloScope 系统监测各组 QBC-939 细胞 7 d 生长动力学曲线
3 讨 论
DNA 甲基化是由 DNA 甲基转移酶（DNMTs）催化的表观遗传修饰，在基因表达调控中发挥关键作用。DNMT1 是 DNMTs 家族中丰度最高、主要负责维持甲基化模式的成员。大量研究证实，多种恶性肿瘤（如结肠癌、胃癌、前列腺癌）组织中 DNMT1 呈高表达，且与抑癌基因启动子区 CpG 岛过度甲基化及转录沉默密切相关。本课题组前期工作已发现，甲基转移酶抑制剂 5‑氮‑2′‑脱氧胞苷可抑制胆管癌细胞增殖并诱导凋亡，提示 DNMT1 可能是胆管癌治疗的重要靶点。
本研究通过构建稳定转染 DNMT1 正义/反义质粒的 QBC-939 细胞模型，从 mRNA 水平验证了外源 DNMT1 表达的调控效率。在此基础上，首次引入 丹麦 BioSense 公司 oCelloScope 微生物生长动态监测系统 评价细胞增殖行为。该系统利用倾斜光学 Z 轴堆叠扫描结合 BCA 图像算法，无需染料标记即可在培养过程中实时、无创地获取活细胞生物量累积数据，避免了传统 MTT 法因代谢活性波动导致的偏差，且时间分辨率更高、通量更大。我们的结果显示，正义 DNMT1 转染后 BCA 曲线提前进入指数增长期、平台期生物量最大；反义 DNMT1 转染则使曲线整体下移、增殖明显受限。这一结果与 DNMT1 mRNA 水平的变化趋势高度吻合，进一步从功能层面证实 DNMT1 的高表达能够驱动胆管癌细胞恶性增殖。
综上所述，本研究成功建立了 DNMT1 表达差异的胆管癌细胞模型，并利用 oCelloScope 系统直观、定量地揭示了 DNMT1 对胆管癌细胞增殖的正向调控作用，为后续深入探索 DNMT1 介导的甲基化机制及其作为胆管癌分子靶点的可行性提供了新的工具和实验依据。
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