AEG-1促进肝癌生长与定向肺转移的作用与机制研究（一）
摘要:目的 研究过表达和沉默AEG-1基因对肝癌细胞生长的影响，以及AEG-1基因在调节肝癌细胞定向肺转移中的作用。方法 分别以携带过表达AEG-1序列及对照基因序列的慢病毒(lentivirus)转染SMMC-7721肝癌细胞株(SMMC-7721-AEG-1-L;SMMC-7721-control-L);以携带shRNA AEG-1及对照shRNA质粒(plasmid)转染SMMC-7721细胞株(SMMC-7721-shAEG-1-P;SMMC-7721-control-P);使用实时定量PCR和Westen blot检测AEG-1的表达;随后使用荧光素酶基因慢病毒包装颗粒转染上述4种稳定转染细胞株。使用上述细胞株分别建立3种裸鼠肝癌模型:皮下移植瘤模型，原位移植瘤模型和血行播散模型;每种细胞株每一模型5只Balb-c裸鼠，共60只。建立皮下移植瘤模型，观测肿瘤的生长情况并绘制肝细胞肿瘤生长曲线;建立肝癌原位移植瘤和血行播散模型，采用生物发光活体成像技术及组织病理学方法监测造模成功率及肿瘤在肝内、肝外转移情况。结果 通过肝癌皮下移植瘤模型可观察到AEG-1过表达组肿瘤体积显著高于对照组，且裸鼠肝脏组织出现弥漫性侵袭转移灶;在肝癌原位移植瘤和血行播散模型中可观察到AEG-1过表达/沉默可以导致肝癌细胞肝内转移、肺转移率和转移灶数量显著增高/降低。结论 过表达AEG-1基因可促进肝癌细胞生长以及定向肺转移，沉默AEG-1基因抑制肝癌细胞生长及定向肺转移。
原发性肝癌(简称肝癌)是中国常见高发的恶性肿瘤之一，而肝癌细胞的血行播散侵袭转移是造成患者死亡的主要原因。肺转移是肝细胞癌最常见的血行转移器官，是肝癌研究的难点。新近研究表明，编码“肺归巢域”蛋白基因AEG-1(astrocyte ele-vated gene 1)在细胞恶性转化、肿瘤转移播散等方面发挥重要作用。我们的前期研究发现高表达AEG-1的肝癌细胞更易向人肺微血管内皮细胞趋化，提示AEG-1可能与肝癌定向肺转移相关。为了证实AEG-1在肝癌中的作用，我们构建稳定过表达AEG-1肝癌细胞株SMMC-7721-AEG-1-L及过表达对照SMMC-7721-control-L，稳定沉默AEG-1肝癌细胞株SMMC-7721-shAEG-1-P及沉默对照SMMC-7721-control-P,并使用上述细胞株建立裸鼠肝癌模型;建立上述4种肝癌细胞株的皮下移植瘤裸鼠模型，观察过表达或沉默AEG-1基因对肝癌细胞生长和发展的作用;建立肝癌原位移植瘤模型和血行播散模型，并用小动物活体成像系统进行监测，研究过表达或沉默AEG-1基因在肝癌定向肺转移中所起的作用。
1材料与方法
1.1细胞培养
以在吉凯基因所购得的慢病毒包装AEG-1(cDNANM_178812)高表达基因编码序列，转染肝
癌细胞株SMMC-7721,获得AEG-1基因过表达细胞株(SMMC-7721-AEG-1-L);包装无任何目的的基因序列pEGFP-N1-3FLAG,转染获得过表达对照细胞株(SMMC-7721-control-L);质粒转染构建的稳定SMMC-7721细胞株:转染含有靶向AEG-1的shRNA(shRNA序列:5'-GCTGACTGATTCT-GGTTCAT-3')质粒获得沉默AEG-1细胞株(SMMC-7721-shAEG-1-P)和转染无任何靶向shR-NA pGCSi-H1/Neo,获得沉默对照细胞株(SMMC-7721-control-P);随后使用荧光素酶基因慢病毒包装颗粒感染上述4种稳定转染细胞株。以上细胞株均由华中科技大学附属同济医院肝病研究所提供，细胞培养方法详见文献。
1.2实验动物
裸鼠购于北京华阜康生物科技有限公司，品系Balb/c nu/nu,SPF级，雄性，3~4周龄。实验过程中对裸鼠的处置符合中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的规定。60只裸鼠分组情况如表1。
表1 60只Balb/c nu/nu裸鼠随机分为4组(n)
| 模型类别 | SMMC-7721-AEG-1-L | SMMC-7721-control-L | SMMC-7721-shAEG-1-P | SMMC-7721-control-P |
| 皮下移植瘤模型 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 原位移植模型 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 血行播散模型 | 5 | 5 | 5 | 5 |
1.2.1建立人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤模型
当上述4组细胞生长状态良好且呈对数生长时，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化细胞，并用吸管吹打，用培养液将消化下来的细胞重新悬浮成单细胞悬液并计数，80xg离心10min后，弃上清液，随后用0.9%的生理盐水吹打，制备单细胞悬液。各组取裸鼠5只，按5x106细胞/0.2mL剂量接种于裸鼠右肩胛皮下。注射后每天观察肿瘤形成及有无红肿、溃破。1.2.2建立肝癌原位移植瘤模型 无菌条件下，分别取上述4组皮下移植瘤小鼠各1只，取瘤后处死。选择活力好的瘤组织浸入无菌生理盐水中漂洗，并切成1mmx1mmx1mm组织块待用;用氯氨酮及地西泮稀释后麻醉裸鼠，沿右侧季肋部横向切口，分离腹肌,暴露肝右叶,剪开肝叶,用3个0的可吸收缝线将1块移植瘤组织缝入肝脏,用明胶海绵填压止血,逐层关腹。
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