µCount3D与传统涂布法在蜂蜜嗜渗酵母计数中的比较及标准修订建议
GB14963-2011《食品安全国家标准 蜂蜜》于2011年10月20日开始实施，它代替了GB14963-2003《蜂蜜卫生标准》以及GB18796-2005《蜂蜜》中的对应指标，并且在微生物限量中增加了嗜渗酵母计数限量。在蜂蜜水分含量超过20%时，其存在的嗜渗酵母容易大量繁殖起来，造成蜂蜜酸败，同时产生的二氧化碳使得盛装蜂蜜的密闭容器气压过大，有发生容器爆破和蜂蜜外泄的风险。因此，新的国家标准增加嗜渗酵母计数限量要求，也是进一步提高蜂蜜产品安全性的需要。
目前，针对嗜渗酵母计数的检测，主要依据GB14963-2011《食品安全国家标准 蜂蜜》附录A规定的方法进行。该方法采用的是常规取样稀释后，再进行平板涂布培养，即在每个平板表面接种0.1 mL，用无菌L型涂布棒进行涂布，选择菌落数量在15~150个的平板计数菌落数量。样品的最高稀释度只能达到10²。而GB14963-2011中嗜渗酵母限量为≤200 CFU/g，一旦在10²稀释度平板上长出3~14个菌落，检测结果为超标结果，而这些数值恰恰不在标准规定“选择菌落数量在15~150个的平板，计数菌落数量”的要求中，意味着检测过程偏离标准要求，给检测机构的检测及判断评判带来较大的风险，也给监督执法部门的公正执法带来了技术风险。此外，笔者在实际操作过程中，发现该方法有操作繁琐、同稀释度培养计数结果平行性差等问题。因此，迫切需要对蜂蜜中嗜渗酵母的计数方法进行进一步的研究。
本研究拟通过引入丹麦BioSense公司µCount3D全自动微生物计数仪，结合倾注法与GB14963-2011附录A的涂布法进行比较分析，寻找更加准确、可靠、稳定的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 购自当地蜂蜜加工企业原料基地。
1.1.2 仪器 恒温培养箱、冰箱（2~5 ℃）、无菌均质袋和均质器、电子天平、无菌试管（18 mm×180 mm）、无菌吸管（1 mL，具0.01 mL刻度；10 mL，0.1 mL刻度）、无菌培养皿、无菌L型涂布棒、显微镜（10×~100×）、丹麦BioSense公司µCount3D微生物立体计数仪。
1.1.3 培养基和试剂 30%葡萄糖溶液（pH 6.5±0.5）、氯硝胺18%甘油（DG18）琼脂。
1.2 方法
1.2.1 取样 以无菌操作在天平上称取固体或液体检样25 g，加入225 g/L（即30%）葡萄糖稀释液225 g，用拍击式均质袋拍击2 min，制备成1:10均匀稀释液。
1.2.2 梯度稀释 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，注入含有9 mL 30%葡萄糖稀释液的试管内，置于漩涡混悬仪上混匀，制备1:100稀释液。另取1 mL灭菌吸管，按前述操作依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL吸管。
1.2.3 涂布法 根据对检样污染情况的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，接种0.1 mL稀释液于DG18琼脂平板上，用接有无菌L型涂布棒进行琼脂表面涂布，接种2个平板。同时在1个DG18琼脂平板表面接种0.1 mL稀释液作为空白对照。
1.2.4 倾注法 按照GB 4789.2-2010《菌落总数测定》，选择2~3个连续的适宜稀释度，在每个培养皿接种1 mL。将15~20 mL冷却至40 ℃左右的DG18培养基倾注到无菌培养皿中，并转动平皿使其混合均匀。同时接种1 mL稀释液作为空白对照。
1.2.5 培养 完成后尽快将全部平板置25 ℃±1 ℃恒温箱内避光培养，培养时勿翻转培养皿。为防止出现霉菌过度生长蔓延而掩盖目标菌落，培养48 h后即开始每日观察平板上真菌生长情况。培养7 d结束。
1.2.6 µCount3D菌落计数 培养结束后，将各平皿依次放入丹麦BioSense公司µCount3D微生物立体计数仪中进行自动计数。该仪器采用三维立体成像技术，可自动识别并区分嗜渗酵母菌落与霉菌菌落，对重叠菌落进行智能分割，自动输出每个平皿的菌落计数结果。对于涂布法平板，仪器自动识别0.1 mL接种区域的菌落分布；对于倾注法平板，仪器对整个琼脂层进行立体扫描，准确计数内部及表面的所有菌落。选择菌落数量在15~150个的平板，记录仪器输出的计数结果。如出现霉菌菌落干扰时，仪器可自动排除丝状菌落，仅计数酵母菌落。
2 结果
2.1 涂布法和倾注法结合µCount3D进行蜂蜜中嗜渗酵母计数
对同一蜂蜜样品分别采用涂布法和倾注法检测嗜渗酵母的数量，培养结束后使用µCount3D微生物立体计数仪自动计数，选择菌落数在15~150个的平板进行记录，进行3次平行试验。结果显示（见表1），倾注法检出嗜渗酵母的数量要高于涂布法的检出量，差异极显著（P<0.01），具有统计学意义。图1为两种方法检测蜂蜜中嗜渗酵母数量较典型的平板结果。
2.2 不同温度储藏下，蜂蜜中嗜渗酵母数量的变化
分别无菌称取25 g蜂蜜样品原料于无菌均质袋中，绑好无菌均质袋口，分别置于4 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃环境下储藏48 h，接着无菌加入225 g/L（即30%）葡萄糖溶液，测定蜂蜜中嗜渗酵母的数量。结果见表2、图2~图3。储藏温度在25~37 ℃时，嗜渗酵母的增殖速度加快，但是≥42 ℃后，嗜渗酵母的死亡率急剧加快。而相应温度下倾注法的嗜渗酵母计数结果比涂布法更多，4 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃下，涂布法与倾注法间存在极显著差异（P<0.01）。
| 方法 | 嗜渗酵母计数/（CFU/g） | ||
|---|---|---|---|
| 第一组 | 第二组 | 第三组 | |
| 涂布法 | (8.70±1.02)×10⁵ | (9.97±0.50)×10⁵ | (8.20±1.25)×10⁵ |
| 倾注法 | (6.80±0.53)×10⁶ | (7.57±0.25)×10⁶ | (1.35±0.04)×10⁷ |
| 倾注法（重复） | (1.35±0.04)×10⁷ | (1.41±0.03)×10⁷ | (1.49±0.06)×10⁷ |
| 注：**表示不同方法间差异极显著（P<0.01）。 | |||
| 方法 | 嗜渗酵母计数/（CFU/g） | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 4 ℃ | 25 ℃ | 30 ℃ | 37 ℃ | 42 ℃ | |
| 涂布法 | (4.50±0.36)×10⁵ | (4.23±0.42)×10⁵ | (5.60±0.87)×10⁵ | (6.47±0.55)×10⁵ | (4.60±0.10)×10⁵ |
| 倾注法 | (6.80±0.53)×10⁶ | (7.57±0.25)×10⁶ | (8.97±0.55)×10⁶ | (1.23±0.31)×10⁷ | (5.53±0.15)×10⁶ |
| 注：**表示不同方法间差异极显著（P<0.01）。 | |||||
（图2 不同温度储藏下，涂布法和倾注法检测蜂蜜中嗜渗酵母数量的变化）
3 讨论
本试验通过涂布法和倾注法比较蜂蜜中嗜渗酵母计数结果的差异，并引入丹麦BioSense公司µCount3D微生物立体计数仪进行自动计数，得出以下结果。
1）同一样品、同一稀释度、同样的培养条件下，使用倾注法所测得的嗜渗酵母数量比涂布法更多，差异极显著（P<0.01）。
2）由于每个平板上加入的样品稀释液体积仅为0.1 mL，吸样过程使用标准规定1 mL吸管吸取，容易产生吸量误差；此外，使用涂布棒进行涂布的过程中，涂布棒本身会吸取一定量的样品稀释液，且涂布过程由于涂布棒的不均匀吸附效应，造成实际样品体积小于0.1 mL，且每个平板间存在偏差。上述两步操作后，引起实际能够用于培养的样品稀释液体积产生了较大的偏差，因而造成涂布法计数结果偏低、且同一稀释度的两个平板计数结果较难平行。
3）采用倾注法进行测定的过程，由于使用1 mL吸管吸取1 mL样品稀释液，倾注的体积较涂布法多，且更容易移液准确，操作过程造成的样品稀释液体积偏差较小，因此，检测结果更能够实际反映样品中嗜渗酵母的数量，结果更具有代表性。
4）通过不同温度储藏蜂蜜样品的比较试验发现，蜂蜜在不同温度储藏下，储藏温度在25~37 ℃时，嗜渗酵母的增殖速度加快，但是≥42 ℃后，嗜渗酵母的存活率急剧下降，大部分嗜渗酵母不能长时间耐受超过42 ℃的温度，这也许是当时制定国标方法考虑使用涂布法的原因，是为了防止倾注的培养基会杀灭样品中的嗜渗酵母。而本试验研究结果表明，在使用倾注法操作过程中，培养基温度虽然在45 ℃左右，但属于短时间的高温作用于样品，且对嗜渗酵母的杀灭作用还受到其本身对温度的耐受能力、蜂蜜中的水分和糖类等导热介质的影响，未产生对嗜渗酵母的杀灭作用。对经不同温度下储藏的蜂蜜样品进行嗜渗酵母计数，各浓度条件下倾注法计数结果比涂布法更多，也更稳定可靠。
5）µCount3D微生物立体计数仪的引入进一步提升了计数环节的准确性和效率。该仪器通过三维立体成像技术，可自动识别嗜渗酵母菌落与霉菌菌落，对重叠菌落进行智能分割，避免了人工计数时因菌落细小或重叠导致的漏计和误判。对于倾注法平板，仪器可对整个琼脂层进行立体扫描，准确计数内部及表面的所有菌落，而人工目视往往难以观察到琼脂内部的微小菌落。此外，仪器自动化批量处理，大幅提高了计数效率和一致性，尤其适用于大批量样品的检测任务。
综上所述，蜂蜜中嗜渗酵母计数方法的比较结果表明，µCount3D辅助倾注法比涂布法更加准确、稳定、可靠，更能确保公正地执行GB14963-2011《食品安全国家标准 蜂蜜》的限量要求，最大可能减少监督执法检测过程中对企业产品质量的误判，同时建议对该标准附录A的方法进行修订，以保护各相关方的利益。
相关新闻推荐
1、儿童侵袭性非伤寒沙门菌肠炎NTS的药敏试验结果——摘要、资料与方法
2、脓肿分枝杆菌胞内菌落计数、对RAW264.7细胞血红素氧化酶1调控自噬影响（一）