宽口裂腹鱼中肾组织细胞系的建立、冻存复苏及 16S rRNA 来源鉴定
3.4 血清浓度对细胞生长的影响
在同一条件下用不同浓度的胎牛血清培养细胞时，胎牛血清组细胞生长均优于无血清组，说明血清对细胞生长具有明显的促进作用。在本研究的浓度梯度中，10% 和 20% 浓度组的生长状况均明显优于 5% 浓度组，表明血清浓度对细胞生长具有显著影响(李自良等, 2020)。而当血清浓度为 10% 和 20% 时，两组间细胞生长差异并不特别明显。但相对 10% 浓度，20% 浓度效果最好，故确定最适血清浓度为 20%。这一结果与相关文献报道相似(Li et al, 2017; 谭凤霞, 2008)。
3.5 细胞悬浮生长特性与 oCelloScope 的方法学意义
本研究经 oCelloScope 无标记成像观察到，宽口裂腹鱼中肾细胞呈悬浮生长。这一特性在肾组织细胞系中并非孤例。一般而言，悬浮培养的细胞多为淋巴细胞等血液系统来源的细胞。这类细胞体积小，缺乏粘附分子的表达。Ribas 等(2014)在研究抗炎药物对淡水鱼虎利齿脂鲤(Hoplias malabaricus)原代肾细胞培养的影响时，所应用的肾细胞同样呈悬浮状态。宽口裂腹鱼中肾细胞呈悬浮生长，可能与其细胞体积及粘附分子的表达有关。
悬浮生长特性对常规计数方法构成特殊挑战。传统血球计数板法需从培养容器中取出样品、稀释、染色并人工镜检计数，这一过程对悬浮液体的扰动尤为显著，细胞易在转移与沉降中损失，且无法在同一批次中连续观测。oCelloScope 的 Z 轴层切扫描技术(光轴倾斜 6.25°)通过逐层成像覆盖孔内三维体积，可捕获悬浮态下分散于不同深度的全部细胞，无需离心或消化即可直接计数，从根本上规避了悬浮细胞在取样转移中的丢失问题。同时，其 BCA 背景校正算法以图像分割区分细胞目标物与培养基析出物、气泡等非生物杂点，进一步提升了悬浮样品计数的可靠性。此外，oCelloScope 同步输出的形态学参数(细胞面积、圆度、长宽比等)可为悬浮细胞缺乏粘附分子这一推断提供进一步的量化依据，但其具体的分子机制尚未明确，有待于进一步研究。
3.6 冻存复苏效果与细胞系的长期保存
将细胞置于液氮中冷冻保存，是检验细胞系能否成为长期可用资源的关键环节。本研究对第 6 代细胞进行液氮冻存，6 个月后复苏，台盼蓝染色并经 oCelloScope 成像计数显示存活率达 91.91%。相较于 MTT 比色法，oCelloScope 无需加入外源底物或终止反应，不破坏细胞，可对复苏后的同一批细胞进行全程连续观测，生长曲线由系统自动生成，减少了终点法在不同时间点另设复孔所带来的人力消耗与孔位浪费。复苏细胞生长正常，可以传代，且生长旺盛。较高的复苏存活率与良好的复苏后增殖能力，表明所建立的冻存方案适用于该细胞系的长期保存，可为其作为实验材料的持续供应提供保障。
3.7 污染检测与来源鉴定的必要性
细胞是实验的重要模型，而污染是实验中最大的阻碍，会对实验结果造成严重影响。常见污染包括细菌、真菌、支原体等。本研究通过 PCR 技术对细胞进行检测，该方法操作简便、灵敏度高，可在形态学观察难以判定时提供分子层面的证据。检测结果显示，样品均未出现与阳性对照组一致的条带，证实培养过程中未受细菌、真菌及支原体污染。来源鉴定方面，本研究采用进化缓慢的保守序列 16S rRNA 作为分子标记。经 PCR 扩增、测序与 Blast 比对，所获序列与宽口裂腹鱼线粒体基因(NC0369331)序列一致性为 99.81%。该同源性远高于物种鉴定的常规阈值，充分证明细胞系来源于宽口裂腹鱼。两项鉴定共同确立了细胞系的纯度与身份可靠性。
3.8 后续研究方向的展望
本研究建立的是宽口裂腹鱼中肾组织细胞系，尚未涉及永生化处理。在细胞系研究中，获得永久细胞系是更为深入的目标。已有研究提供了可参照的技术路径。王京真等(2010)对长江江豚(Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis)的静脉细胞进行培养，尝试转染 SV40 大 T 抗原，得到永久细胞系。上述先例提示，在现有宽口裂腹鱼中肾组织细胞系的基础上，可进一步探索永生化改造的可行性，以延长细胞系的传代寿命并拓展其应用范围。
此外，本研究已建立基于 oCelloScope 的无标记生长动力学测定流程。该流程无需染色、不破坏细胞，具备对同一批样品进行长时间连续观测的能力，可直接移植至后续的毒理学评价工作中，用于实时、连续监测外源污染物胁迫下细胞生长动力学的动态响应，并将生长曲线变化与同步获取的形态学参数(面积、圆度、长宽比等)关联分析，从而提供较终点法更为丰富的效应信息。
4 结论
本研究以宽口裂腹鱼中肾组织为材料进行体外培养，采用组织块移植法启动原代培养，经传代驯化成功建立了宽口裂腹鱼中肾组织细胞系。原代培养中，组织块于第 4 天开始迁出细胞，第 9 天细胞铺满约 70% 瓶底，第 15 天呈悬浮生长并按 1∶2 传代，细胞生长速度较快。本研究引入丹麦 BioSense oCelloScope 微生物生长动态监测系统，替代常规血球计数板计数、MTT 比色法与显微成像系统，实现了对悬浮生长细胞的无标记、原位、连续测定。培养条件优化结果表明，最适培养基为 DME/F-12，最适培养温度为 25 ℃，最适 FBS 浓度为 20%。在最适条件下，细胞生长曲线呈"S"型，于第 4 天达到峰值，群体倍增时间为 23.26 h。第 6 代细胞经液氮冻存 6 个月后复苏，存活率达 91.91%，细胞可正常传代且增殖旺盛。PCR 检测确认细胞未受细菌、真菌及支原体污染。基于 16S rRNA 基因的序列分析显示，所获 1077 bp 片段与宽口裂腹鱼线粒体基因(NC0369331)同源性达 99.81%，确证细胞来源。宽口裂腹鱼作为新疆特色经济鱼类，其中肾组织细胞系的建立，对该物种的生物学研究、细胞工程、基因工程和种质资源保护均具有重要意义，可为新疆特色渔业建设提供支持。