oCelloScope量化证实TrI9过表达不损害孢子萌发与生长
本研究证实，通过在里氏木霉中分泌表达天然 I9 型抑制剂 TrI9，可在不损害宿主适应度的前提下有效解决重组蛋白的蛋白酶降解难题。研究以酵母 Pbi2 结构为探针经 FoldSeek 鉴定出 TrI9（trire2_122168），其与 Pbi2 序列一致性仅 28% 但折叠高度保守，功能域为 81–151 位。AlphaFold3 预测 TrI9 以类底物方式占据 SLP2 底物结合沟槽、C 端终止于 P1 位点，呈纯竞争性抑制构型，结合自由能（−80.89 REU）与 SLP2 自身 I9 自抑制域相当，并高置信地指向 SLP2、SLP3、SLP5、SLP6、SLP8 多个靶点。体外实验验证合成 TrI9（82–151）肽段可剂量依赖抑制 SLP2，且在 100 nM 下抑制 SLP1、SLP3、SLP6、SLP8，对天冬氨酸蛋白酶 PEP4 无效。体内应用中，亲本株与 ΔTrI9 株几乎检不到全长 CBM-AQ12-CBM，而 TrI9 过表达株均检出完整蛋白；Ambr 250 反应器中 HFB1ss-TrI9 株在 pH 5 下达到 0.5 g/L（优于 Δslp2 株），pH 降至 4 时 XYN2 载体株进一步提升至 1.5 g/L，且稳定性更持久、目标/总蛋白比更高，同时胞外总蛋白酶活性显著低于亲本、ΔTrI9 甚至 Δslp2 株（后者仅降低约 75%）。关键的是，oCelloScope 延时显微与反应器数据一致显示，TrI9 过表达或缺失基本不影响萌发、生长速率、总生长量、产孢及代谢，而 Δslp2 株在所有生长与萌发指标上显著劣化且孢子形态异常。
图2、TrI9的过表达可稳定小规模培养中蛋白酶敏感丝素蛋白CBM–AQ12–CBM。在24孔板中，用XYN2载体或HFB1ss载体分别构建长链和短链变体，培养产生CBM AQ12 CBM的T. reesei菌株，并对蛋白质完整性进行分析。使用C端Strep II标签结合考马斯染色的SDS-PAGE检测CBM AQ12 CBM，结果显示总分泌蛋白。全长蛋白以星号标示，低分子量条带代表降解产物。b 采用GFP-Strep tag II标准曲线，根据Western blot信号强度定量完整CBM AQ12 CBM。数据为两个独立生物重复实验的平均值±标准差（n = 2）。
图3、不同T. reesei菌株的孢子萌发、生长动态及孢子形态。a 通过微生物动态监测系统（oCelloScope）量化真菌生长动力学。生长曲线基于SESAfungi标准化信号，反映真菌表面积随时间的变化情况。b 通过自动化时间序列（oCelloScope）测量的孢子萌发率（%），随时间变化。虚线表示50%萌发阈值。c 通过自动化时间序列显微镜（oCelloScope）测量的真菌生物量总增长情况。所有曲线均为每种菌株八次重复实验的平均值，曲线周围阴影区域表示标准差。d 使用oCelloScope获取的显微图像，显示不同T. reesei菌株在接种后11小时萌发前的孢子形态。Slp2缺失菌株的孢子形状不规则（箭头所示），而其他菌株的孢子呈圆形。
图4、TrI9的过表达降低了生物反应器培养中的胞外蛋白酶活性。在第1、3、4和5天采集的培养上清液中测定了蛋白酶活性。将60分钟后与荧光酪蛋白底物孵育后的荧光信号首先按各样品的总蛋白浓度进行归一化（表S2），再按每个时间点的母株菌株进行归一化（设为1）。除非另有说明，所有菌株均在pH 5条件下培养。图中所示菌株包括：母株菌株、ΔTrI9、Δslp2、HFB1ss-TrI9、XYN2载体-TrI9、pH 4的母株菌株以及pH 4的XYN2载体-TrI9。条形图表示单次生物反应器培养中三个技术重复样本的平均值±标准差。
图5、生物反应器培养过程中的基质消耗、生物量积累和碳转化速率。反射率数据通过广义加性模型（GAMs，R）进行平滑和插值处理。反射信号经由使用rlm函数（MASS包，R）拟合的稳健线性校准模型转换为干物质质量。残留乳糖通过高效液相色谱法（HPLC）测定。结果基于单个生物反应器培养的数据。
总结
研究表明，基于天然抑制剂的蛋白酶调控可替代基因敲除与化学抑制剂，但 TrI9 的分泌效率、稳定性与工艺条件仍需优化，且目前仅验证了单一目标蛋白。oCelloScope微生物动态监测系统（丹麦）是本研究中用于评估宿主适应度的自动化延时显微成像系统，其核心作用是为"TrI9 抑制策略优于 slp2 基因敲除"这一中心论点提供定量表型证据。oCelloScope 在论文中承担的并非单纯的形态观察，而是把"过表达 TrI9 会不会拖累菌体"这一工程化关键担忧转化为可统计、可复现的高通量动力学数据，与生物反应器中的底物消耗、CER 和生物量（反射光）曲线相互印证，最终支撑了讨论与结论的核心判断。
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