mpc1 基因缺失对粟酒裂殖酵母有丝分裂全过程的动力学影响：从纺锤体到胞质分裂
3 讨论
粟酒裂殖酵母作为经典的模式细胞，其研究结果为人类疾病的研究提供了重要的方向。Win 等研究发现，在粟酒裂殖酵母中，RecQ DNA 解旋酶家族的 Rqh1（RecQ type DNA helicase）参与调控了染色体分离，该调控在人类细胞也存在，人类 Rqh1 异常会导致染色体分离异常，并导致 RecQ 解旋酶疾病，甚至增加癌症发病率。RecQ 解旋酶家族已被作为癌症治疗潜在靶点进行相关研究。线粒体丙酮酸载体 MPC1 和 MPC2 组成了 MPC。MPC1 / MPC2 几乎在所有细胞中都表达，但不同物种中 MPC1、MPC2 蛋白功能有差异。
MPC1、MPC2 的亲缘关系对比结果显示，粟酒裂殖酵母 MPC1、MPC2 的亲缘关系比酿酒酵母更接近哺乳动物。对比六个物种的 MPC1 和 MPC2 蛋白发现，MPC1 蛋白包含 N-糖基化位点、蛋白激酶 C 磷酸化位点等 5 种功能位点（图 7A），MPC2 蛋白包含 N-肉豆蔻酰化位点、cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点等 4 种功能位点（图 7B）。其中，酪氨酸激酶磷酸化位点和酪蛋白激酶 II 磷酸化位点是粟酒裂殖酵母 MPC1 特有的功能位点，而 cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点是粟酒裂殖酵母 MPC2 特有的功能位点。细胞形态受多种基因调控。
Yoshida 等研究发现，编码 WD 重复蛋白（WD repeat protein Cdt2）的基因 cdt2 缺失后，细胞长于野生型。本研究发现，mpd1 基因缺失也会导致细胞变得细长，提示 mpd1 参与调控细胞长度。微管（MT）主要由 α 和 β 微管蛋白异二聚体组成，是真核细胞骨架的重要组成部分，参与控制细胞形状、运动和分裂。在有丝分裂期，微管组装形成纺锤体，纺锤体是一种双极结构，对染色体准确分离至关重要。纺锤体在有丝分裂前期和中期缓慢伸长，后期伸长速度加快，纺锤体伸长是染色体移动到细胞两极的重要作用力。Asp1（inositol hexakisphosphate kinase / inositol pyrophosphate synthase asparaginase ASP1，肌醇六磷酸激酶 / 肌醇焦磷酸合酶）是一种双功能酶，由一个产生 IPP（isopentenyl pyrophosphate，异戊烯基焦磷酸）的激酶结构域和一个使用 IPP 作为底物的焦磷酸酶结构域组成，IPP 参与调节微管稳定性。
Pascual-Ortiz 等、Topolski 等研究发现，缺乏 Asp1 导致 IPP 生成障碍，引发标准温度下有丝分裂期纺锤体伸长时间缩短、伸长速率加快。Dis1（TOG / XMAP215 microtubule plus end tracking polymerase Dis1）是一种微管聚合酶，定位在微管末端，Mal3（microtubule plus-end binding protein, EB1 family Mal3）是微管正末端结合蛋白，Mal3 进一步促进 Dis1 募集到微管末端。Dis1 与 Mal3 C 端区域内形成的保守疏水腔相互作用，Mal3-Dis1 异常通常导致细胞动力学异常。
Matsuo 等研究发现，dis1 基因缺失导致标准温度下有丝分裂纺锤体后期伸长速度加快，mal3 基因缺失导致标准温度下有丝分裂后期的持续时间增加，分裂期总持续时间也增加。本研究发现，25 ℃下 mpc1 基因缺失也会缩短纺锤体后期伸长时间，提示 mpc1 参与调控有丝分裂后期纺锤体伸长。
图 7 六个物种 MPC1、MPC2 蛋白的氨基酸序列及功能位点分析
A：不同物种中 MPC1 功能位点对比；B：不同物种中 MPC2 功能位点对比
染色体的正确分离依赖于纺锤体功能的正确执行。Grishchuk 等研究发现，编码驱动蛋白家族负端定向微管马达（kinesin-14 family minus-end directed microtubule motor Pkl1）的 pkl1 基因缺失，导致纺锤体极微管突起异常，异常突起的微管随后将一个后期分离的染色体推到细胞分裂部位，导致胞质分裂时染色体切割，从而产生非整倍体细胞，最终形成无法存活的子细胞。dam1 基因编码 DASH（DASH complex subunit Dam1）复合体亚基 Dam1，DASH 是着丝粒上的一种蛋白质复合物，当着丝粒附着到纺锤体上时，该复合物与微管结合，DASH 在纺锤体附着、染色体分离和纺锤体稳定性中发挥作用。
Griffiths 等研究发现，dam1 基因缺失后，有丝分裂纺锤体组装但不伸长，纺锤体极体无法分离。纺锤体异常通常伴随着染色体分离异常。Sanchez-Perez 等发现，dam1 基因缺失会导致染色体被异常切割，子细胞无法存活。
本研究结果显示，25 ℃下 mpc1 基因缺失导致染色体分离时间极显著性缩短，同时，染色体开始分裂到细胞形成隔膜的时间缩短、时间占比减小，这与纺锤体中后期时间极显著性缩短相符合，提示 mpc1 通过调控纺锤体中后期的动力学参与调控染色体后期的分离。细胞肌动蛋白有单体小球（G-肌动蛋白）和聚合物长丝状（F-肌动蛋白）两种形式，它们之间能相互转换，肌动蛋白参与了细胞运动、维持细胞形状和极性以及转录的调节。
在有丝分裂期间，肌动蛋白在细胞中央位置慢慢聚集，与肌球蛋白及相关蛋白一起形成肌动蛋白收缩环，随着有丝分裂的进行，肌动蛋白收缩环逐渐向内收缩，将细胞一分为二。Blt1（ubiquitin domain-like protein Blt1）是一种泛素结构域样蛋白，该蛋白有助于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 Sid2（serine/threonine protein kinase (NDR family) Sid2）及其调节蛋白 Sid2-Mob1 激酶复合物调节亚基 Mob1（Sid2-Mob1 kinase complex regulatory subunit Mob1）在分裂位点的定位。
Kwon 等研究发现，blt1 基因缺失后，收缩环组装是正常的，但会导致分裂位点 Sid2p / Mob1p 含量比减小，从而延迟了收缩环收缩和细胞分裂的完成。分裂开始时，抑制蛋白相关底物接头蛋白 Art1（arrestin-related substrate adaptor for RhoGEF）募集 Rho 家族鸟嘌呤核苷酸交换因子 Rgf3（Rho-GEF for Rho1）定位到分裂位点，并由 Rgf3 调控胞质分裂调节因子 Rho GTP 酶，介导肌动蛋白环正常形成。Davidson 等、You 等研究发现，art1 基因缺失导致肌动蛋白聚集时间延长。本研究结果显示，25 ℃下 mpc1 基因缺失后也导致肌动蛋白环形成时间延长，提示 mpc1 参与调控有丝分裂收缩环的形成时间，从而调控裂殖酵母胞质分裂过程。
在本研究中，我们引入了丹麦 Biosense 微生物生长动态监测系统 oCelloScope，用于辅助分析 mpc1 基因缺失对粟酒裂殖酵母群体生长及细胞形态的影响。该系统能够实现高通量的明场成像和自动化数据分析，相较于传统的分光光度法（如 OD595 测定）和人工显微计数，oCelloScope 能够在同一实验中连续、实时地记录大量细胞的生长动态，并通过其内置的 BCA 算法和 SESA 算法，自动提取生长曲线和单细胞的形态学参数（如细胞长度、面积和纵横比）。这种高通量、自动化的监测方式极大地提高了数据的统计效力和可重复性，有效减少了人工操作带来的误差。在未来的研究中，oCelloScope 系统可作为酵母细胞群体动力学和形态学分析的标准化工具，尤其适用于大规模筛选或多种条件下的表型比较，为深入理解基因功能提供更加全面和精准的数据支撑。
综上所述，粟酒裂殖酵母中 mpc1 基因缺失虽然促进了纺锤体伸长和染色体分离，但减缓了肌动蛋白环形成和收缩，最终导致细胞生长缓慢。本研究结果为进一步探究 MPC1 蛋白功能提供了一定的科学依据，也为研究 mpc1 基因异常导致的疾病提供参考。
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