固相合成法制备抗菌肽 WMR-4 及其功能化衍生物的实验流程
材料与方法
材料
Nα-Fmoc 保护的氨基酸购自 GL Biochem Ltd.（上海，中国）。Rink 酰胺 p-甲基二苯甲基胺（MBHA）树脂、Fmoc-Lys(Mtt)、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-O2Oc-OH、哌啶、麦角固醇、三氟乙酸（TFA）、Oxyma pure 和 1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓 3-氧化六氟磷酸盐（HATU）购自 Iris-Biotec GmbH。1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）、溶剂如 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）和氯仿、十九烷酸（C19）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）、三异丙基硅烷（TIS）、尼罗红、硫黄素 T 和 N,N-二异丙基乙胺（DIEA）购自 Merck（米兰，意大利）。
磷脂：1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、罗丹明和 12-(N-甲基-N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基))（NBD）-磷脂酰乙醇胺（分别为 Rho-PE 和 NBD-PE）购自 Avanti Polar Lipids（伯明翰，阿拉巴马州，美国）。
肽合成
WMR-4 以及肽 P1、P2、P3 和 P2-a 是通过标准固相 Fmoc（9-芴甲氧羰基）化学法在 Rink 酰胺树脂（负载量：0.63 mmol/g）上合成的（表 1）。
表 1：肽 WMR-4、P1、P2、P3 和 WMR4-P2 的序列
| 简称 | 肽 | 序列 |
| WMR-4 | WMR-4 | NH₂-Trp-Aib-Ile-Arg-Arg-Ile-Leu-Lys-Tyr-Gly-Lys-Arg-DSer-DLys-CONH₂ |
| P1 | NH₂-Gly-Asp-Asp-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(C19)-CONH₂ | |
| P2 | NH₂-Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(C19)-CONH₂ | |
| P3 | gH-P2 | NH₂-His-Gly-Leu-Ala-Ser-Thr-Leu-Thr-Arg-Ala-Trp-Ala-His-Tyr-Asn-Ala-Leu-Ile-Arg-Ala-Phe-Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(C19)-CONH₂ |
| P2-a | WMR-4-P2 | NH₂-Trp-Aib-Ile-Arg-Arg-Ile-Leu-Lys-Tyr-Gly-Lys-Arg-DSer-DLys-PEG2-Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(C19)-CONH₂ |
对于肽 P1、P2、P3 和 P2-a，采用 Fmoc-Lys(Mtt)-OH 作为第一个氨基酸，以便在赖氨酸侧链上进行十九烷酸（C19）的选择性偶联。
在肽序列延伸过程中，每次 Fmoc 脱保护通过用 30% 哌啶/DMF 溶液处理（2 x 10 分钟）完成，而偶联反应分两步进行：(i) Fmoc-保护氨基酸（2 当量）、DIC（2 当量）和 Oxyma pure（2 当量）溶于 DMF，反应 40 分钟；(ii) Fmoc-氨基酸（2 当量）、HATU（2 当量）和 DIPEA（4 当量）溶于 DMF，反应 40 分钟。
对于 C19 的偶联，通过用由 DCM:TFA:TIS（94:1:5，v/v/v）组成的裂解液反复处理（15 个循环）树脂，从赖氨酸侧链上去除 Mtt 保护基团。脱保护是否完成通过比色 Kaiser 测试验证，该测试检测固体支持物上的游离伯胺。脂质偶联使用 C19（2 当量）、DIC（2 当量）和 Oxyma pure（2 当量）溶于 NMP 进行，随后使用 HATU（2 当量）和 DIPEA（4 当量）溶于 NMP 进行第二次偶联步骤，反应 2 小时。使用 TFA/H₂O/TIS（95:2.5:2.5，v/v/v）的混合物在搅拌下将肽从树脂上裂解下来，持续 3 小时。裂解后，通过加入冷乙醚沉淀肽，并通过离心收集（2 个循环，每次 6000 rpm，15 分钟）。
对于纯化，WMR-4 粗产物溶解于含 10% 乙腈的水溶液中，而自组装肽粗产物溶解于含 10% HFIP 和 0.1% TFA 的水溶液中。纯化使用半制备型反相 HPLC 和 Phenomenex Kinetex C18 色谱柱（5 μm，100 Å，150 x 21.2 mm）进行。洗脱使用溶剂 B（含 0.1% TFA 的乙腈）在溶剂 A（含 0.1% TFA 的水）中的线性梯度，从 10% 到 90%，持续 20 分钟，流速为 15 mL/min，紫外检测波长为 220 nm。所有肽的身份通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）确认，纯度通过分析型 HPLC 在 Phenomenex Jupiter 4u Proteo 色谱柱（90 Å，150 x 4.6 mm）上检查（参见支持信息，图 S1-S5）。
针对尖孢镰刀菌的体外和体内抗真菌评估：真菌菌株和培养条件
本研究全程使用番茄致病性分离株尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fo）race 2 分离株 4287（FGSC 9935）。对于小分生孢子的生产，菌株在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中于 28°C 下振荡培养（160 rpm），持续 3-5 天，直至观察到大量孢子形成。小分生孢子通过无菌尼龙网（10 μm 孔径）过滤以去除菌丝体，然后在 5,000 rpm 下离心 10 分钟进行收集。沉淀重悬于无菌蒸馏水中，使用 Bürker 计数室测定分生孢子浓度。根据特定实验要求，通过无菌蒸馏水进行系列稀释，将分生孢子悬浮液调整至所需密度，最终浓度范围为 1x10⁴ 至 1x10⁶ 个分生孢子/mL。所有实验立即使用新鲜制备的分生孢子，或者将其保存在含 30% 甘油的 -80°C 下备用。
生长抑制试验
生长抑制试验在 96 孔微量滴定板中使用分光光度法进行。将新鲜的分生孢子（3.19 x 10⁶ 个分生孢子/mL）重悬于萌发培养基（GM）中。将分生孢子悬浮液与浓度为 10 至 100 μM 的 WMR-4，或与浓度为 2.5 至 40 μM 的纳米纤维制剂（NF）一起孵育。对照孔仅含 GM。使用多功能酶标仪（Tecan Infinite 200 Pro F Nano+；Tecan，Männedorf，瑞士）每 30 分钟测量一次 600 nm 处的吸光度，监测生长情况，持续 14 小时。所有处理至少进行三次生物学重复，实验至少在两个独立场合进行。结果表示为平均值 ± 标准差，显著性水平设定为 p < 0.05（），p < 0.01（），p < 0.001和 p ≤ 0.0001。
芽管形成试验
使用 oCelloScope 自动成像系统和 UniExplorer 软件（版本 11.1.0.8756）（BioSense Solutions ApS，丹麦）监测芽管形成。将新鲜的分生孢子（每孔 1.5x10⁴ 个）重悬于 pH 7.0 的 GM 中，并分配到 96 孔板中，加入与生长抑制试验相同浓度的测试化合物。每 30 分钟扫描一次物体，持续 14 小时，在开始测量前先孵育 15 分钟以使分生孢子完全沉降。然后，oCelloScope 使用内置的小分生孢子算法分析并归一化每孔随时间变化的真菌质量（每个测试条件 n=3），该算法通过分割和提取表面积算法生成生长曲线的原始数据，以量化形态变化。每孔追踪至少 500 个单个分生孢子，每次处理进行三次生物学重复。使用适当的检验对处理组间的萌发率进行比较统计分析，数据表示为平均值 ± 标准差。
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