鸡印第安纳株沙门菌生长、致病性及药物敏感性研究（二）
1.4生长曲线测定
将分离的菌株接种到LB培养基中，于37℃摇床振荡培养，采用全自动微生物生长动态监测系统测定菌液600 nm的吸光值(OD600)，当OD600值达到1时，将菌液按1∶100进行稀释后，接种到新鲜的LB培养基中120 r/min摇床培养，每隔1 h取出，测定OD600值，连续测16 h，绘制菌液吸光度曲线;分别在1、2、4、8、10、12、14、16 h吸取培养菌液，用LB肉汤进行10倍梯度稀释，并接种在LB平板上，37℃培养16 h，计数菌落，绘制活菌数变化曲线。
1.5毒力测定
将分离鉴定后的菌株接入LB液体培养基，37℃200 r/min培养12 h获得菌液。将菌液离心，收集菌体，使用生理盐水清洗菌体2次后备用。将30只3日龄SPF雏鸡随机分为5组，每组6只。第1~5组雏鸡肌肉注射菌液，接种剂量依次为1.50×107、1.50×106、1.50×105、1.50×104、1.50×103 CFU，对照组雏鸡接种等量生理盐水，观察7 d内雏鸡发病及死亡情况，并计算分离菌半数致死量(LD50)。在接种后第3天，对3只病死雏鸡和2只健康雏鸡进行解剖检查，观察组织器官病变情况。
1.6耐药性检测
取分离菌株接种于LB培养基，于37℃摇床振荡培养过夜。用无菌生理盐水将菌液稀释至0.5麦氏浊度标准。取灭菌棉签蘸取菌液均匀地涂布于MH琼脂平板。按WHO提供的Kindy-Bauer操作方法将药敏纸片贴在涂布细菌的MH琼脂平板上，37℃过夜培养，测量抑菌圈的直径，按照药敏纸片说明书进行药物敏感性判定。
1.7全基因组测序分析
分离菌株的全基因组测序委托上海凌恩生物科技有限公司完成，测序过程按照标准流程进行。提取高质量细菌DNA并进行质量检测，采用PacBio平台构建测序文库、文库质量检测和文库测序，使用Unicycler v0.4.8以默认参数进行基因组组装，并通过Circlator v1.5.5软件构建菌株完成图。细菌基因模型使用GeneMarkv4.17进行识别。将所有基因模型与NR、eggNOG、SwissProt、KEGG、COG数据库模块进行比对，完成基因功能注释。利用综合的抗生素抗性基因数据库CARD发掘分离株的耐药基因。采用毒力因子数据库VFDB比对菌株的毒力因子。使用SeqSero 1.2数据库对菌株进行血清型分析，PlasmidFinder 2.1分析质粒类型;采用IECfinder预测基因组的可移动元件。
1.8比较基因组学分析
以NCBI数据库中6株国内分离的鸡源印第安纳沙门菌基因组作为参考基因组，与测序获得的分离株SM24全基因序列进行比较分析，6株参考菌株的信息见表1。
采用序列比对软件MUMmer鉴定菌株的同源基因，并使用CD-HIT快速聚类分析对菌株基因组Core/Pan基因进行聚类，鉴定菌株共有和特有基因。利用MUSCLE软件进行菌株Core基因多序列比对，并使用PhyML软件中的最大似然法(ML法)构建菌株进化树。
表1参考菌株信息
2结果与分析
2.1沙门菌分离与鉴定
发病鸡病料经PBW预增菌和MM培养基的选择性增菌，接种至XLT4选择性平板上，37℃培养24 h，其中1份样品培养出圆形、边缘整齐、呈灰白色，中心呈黑色、大小均一的单一菌落(图1A)。经革兰染色，该菌被染成红色，菌体呈短杆状(图1B)，初步判定该菌为革兰阴性的沙门菌。提取细菌基因组，采用细菌通用16S rRNA引物进行扩增，获得大小为1 500 bp左右的PCR产物(图2)，并对产物进行测序，将16S rRNA基因序列在NCBI数据库进行BLAST比对，其序列与沙门菌属的同源性均高·26·Animal Husbandry&Veterinary Medicine 2025 Vol.57 No.4于99%，因而确定分离菌株为沙门菌，命名为SM24株。
图1分离菌株在XLT4平板上的菌落形态(A)和革兰染色镜检(B)(1 000×)M.DL2000 DNA Marker;1、2.16S rRNA基因的PCR产物。
图2分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增产物
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