家兔肺支气管败血波氏杆菌生长曲线测定及耐药性研究（一）
摘 要:为深入了解兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica, Bb),试验将病兔体内分离得到的菌株进行菌株鉴定、生长曲线测定、致病性研究、药敏试验及耐药基因检测,期望了解该菌的生长规律,为临床用药及防控奠定基础。通过 Gram 染色镜检、分离培养、16S rDNA 序列分析对分离菌株进行鉴定,测定了该分离株的生长曲线、半数致死量、耐药性并对分离菌株进行 β-内酰胺酶耐药基因的检测。结果表明:分离得到 1 株革兰氏阴性杆菌,命名为 P201215,该分离株的 16S rDNA 基因序列与 GenBank 中支气管败血波氏杆菌(登录号为 NR113628.1)的同源性为 99%。分离株的对数生长期为 2~9 h,9 h 后进入平台期;对 KM 小鼠的半数致死量为 1.19×107 CFU。药敏试验结果显示,分离株对部分头孢菌素类药物耐药,对大部分 β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类及氨基糖苷类药物敏感,PCR 检测未检出超广谱 β-内酰胺酶耐药基因。
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是革兰阴性小杆菌,大小为 0.2~0.5 µm×0.5~2.0 µm,无芽孢。本菌能够感染多种哺乳动物,如猪、家兔、马、犬等,主要引起猪萎缩性鼻炎和兔波氏杆菌病。支气管败血波氏杆菌感染兔后能导致病兔体温升高、咳嗽、流鼻涕及突然死亡,出现支气管肺炎及肺脓肿等病理变化。在养殖行业中,该菌常与兔巴氏杆菌、葡萄球菌等混合感染,无症状携带或有临床症状均会给养殖者造成巨大的经济损失,而家兔是伴侣动物,兔波氏杆菌病也意味着人畜共患的风险。
目前该病的治疗措施以抗生素治疗为主,但由于目前 β-内酰胺类抗生素是临床上使用最广泛的抗生素,许多病原体对 β-内酰胺酶类抗生素已产生严重的耐药性,其中革兰氏阴性杆菌对该类药物的耐药率持续上升。多篇研究指出,支气管败血波氏杆菌对青霉素类和头孢菌素类药物存在较高的耐药性,其机制为细菌产生 β-内酰胺酶水解药物中的 β-内酰胺环从而使药物失活。超广谱 β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamerses,ESBLs)能够水解 β-内酰胺酶,主要由肠杆菌科细菌产生,ESBLs 基因在质粒介导下,可通过接合、转化和转导等多种形式在细菌间扩散,是细菌对 β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主因。因此,检测分离株的耐药性及 ESBLs耐药基因对指导临床用药有重要意义。
试验所用菌株是从死亡家兔肺组织病料中分离得到,经测序鉴定为支气管败血波氏杆菌,试验对其进行生长曲线测定,以了解其生长规律。同时用分离株测定其对 SPF 级 KM 小鼠的半数致死量,并进行了耐药性和 β-内酰胺酶基因检测,以期为后续对本菌的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
病料与试验动物:病死家兔收集于某兔业合作社。SPF 级 KM 小鼠,18~22 g,36 只,雌雄各半,购自成都达硕实验动物公司。
主要试剂和仪器:LB液体培养基、含5%血清的TSB琼脂培养基、MH培养基、1 mL注射器、胎牛血清等;抗菌药敏纸片,购自杭州微生物试剂有限公司;DNA 分子量标,购自北京擎科生物科技有限公司;细菌基因组 DNA 提取试剂盒,购自天根生化(北京)有限公司;PCR 扩增仪、核酸电泳仪等,购自美国百乐公司;紫外线分光光度计、台式冷冻离心机,购自赛默飞世尔科技公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离纯化、16S rDNA 基因扩增及序列分析
无菌采集病死动物肺组织,连续划线接种于含 5% 血清的 TSB 培养基上,37 ℃培养 24 h,挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检,观察菌落形态及细菌大小形态。将单个菌落纯化后加入甘油与生理盐水 1∶1 体积比混匀液中,保存于-80 ℃。
用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取分离株 DNA 进行 PCR 扩增,引物序列见表 1。反应体系(20 µL):2× Taq PCR Master 10 µL,上下游引物各 1 µL,DNA 模板 1 µL,dd H2O 补足反应体系至 20 µL。反应程序:98 ℃预变性 3 min;98 ℃变性 15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸 25 s,进行 35 个循环;72 ℃额外延伸 5 min。扩增后的产物经 1% 琼脂凝胶电泳检测后送北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果经 BLAST 比对后,筛选 14 株 GenBank 上公布的相关细菌的 16S rDNA 进行同源性分析。利用 MEGA 7.0 软件中的邻接法(Neighbor-joining)构建进化树。
相关新闻推荐
2、三种抗菌药物处理后持留菌株和抗药菌株生长曲线、优势的比较——结果与分析、讨论与结论
3、牛源解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力测定、抗逆性及药敏试验（三）