水产养殖迟钝爱德华氏菌生长曲线及对链霉素敏感性检测（二）
1.5利用阿尔玛蓝显色法测定迟钝爱德华氏菌JF-1对11种药物的敏感性
1.5.1药敏检测微孔板的制备
依据水产常用药物种类和禁用药物目录，选择氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平制备药敏检测板。根据不同药物的特性分别采用不同的溶剂准确配制成初始质量浓度为6.4、6.4、5.12、6.4、6.4、5.12、6.4、1.28、5.12、2.56、3.2mg/mL的抗菌药物储液，经0.22μm滤膜过滤后，并依次加入药敏检测区(A1~H11)内，每孔加入10μL，最终药敏检测板包被的抗菌药物见图1。在生长对照区(A12~D12)和空白对照区(E12~H12)内每孔加入10μL无菌超纯水作为对照。
注:1~11:不同药物种类;A~H:不同药物量;A1~H11:药敏检测区;A12~D12生长对照区;E12~H12:空白对照区.
1.5.2根据颜色判断不同药物的最小抑菌质量浓度
将菌株JF-1接种于MH2培养基中进行快速增殖,待菌液浊度达到0.5个麦氏比浊度时,用MHO稀释为1x105个/mL,加入药敏检测微孔板的药敏检测区及生长对照区，每孔80μL。在空白对照区内每孔滴加80μL M H0培养液，在所有微孔内分别加人10μL阿尔玛蓝指示剂，置于28℃培养箱中静置避光培养8~14h。待生长对照区由蓝色变为粉色时，取出药敏检测微孔板，肉眼观察记录各微孔内的颜色变化情况。每列中与粉红色微孔相邻的蓝色(或蓝紫色)孔所对应的药敏包被浓度即为该药物对菌株JF-1的最小抑菌质量浓度。
1.6根据OD值判断不同药物的最小抑菌质量浓度
取一块预先参照1.5.1同等操作制备的包被不同药物的96孔无菌酶标板，参照药敏检测微孔板平行对应地加入待检菌液，置于28℃培养箱中静置培养。在对上述快速药敏检测微孔板根据颜色变化进行最小抑菌质量浓度结果判读的同时，将接种有待检菌的酶标板以酶标仪在595nm波长下测定各微孔的OD值，并参照1.4所述方法计算各微孔内的细菌存活率并判定最小抑菌质量浓度。
1.7利用常规试管稀释法进行药物敏感性测定
在一系列无菌透明试管中分别接种如图1所示的含8个质量浓度梯度11种药物的菌液,每管接种800μL,菌液密度为1x10个/mL,每个药物质量浓度设3个重复,以通气硅胶塞封口后置于28℃培养箱中静置培养,肉眼连续观察试管内菌液浊度变化,直至各试管内浊度稳定后,记录结果,以未出现浑浊试管所对应的最小药物质量浓度为最小抑菌质量浓度。
2结果
2.1不同增菌液对迟钝爱德华氏菌增殖效果的影响
通过菌株JF-1在增菌液MH0、MH1和MH2内的生长曲线情况(图2),可以看出改良后的MH1和MH2增菌效果均优于MH0,不仅能够缩短菌株JF-1的生长延滞期，使细菌在10h内进入指数生长期,且最终生物量也显著高于MH0,由于鱼肉蛋白胨产品批次间差异较自制鱼汤小，因此将MH2作为药敏快速检测方法的增菌培养基,为了避免添加鱼肉蛋白胨对药敏检测结果的干扰,以MH0作为药敏检测基础培养基。
2.2药敏检测菌液接种密度的确定
通过在不同密度菌液中加入阿尔玛蓝后,1x 10^8个/mL菌液在接种1h后，由蓝色完全变为粉红色,1x107个/mL菌液在2h之后完全变为粉红色,1x106个/mL菌液在7h之后完全变为粉红色,1x 105个/mL菌液在12h之后完全变为粉红色,1x 10个/mL菌液在16h之后完全变为粉红色,1x 103个/mL菌液在17h之后完全变为粉红色。考虑快速药敏检测的时间跨度需求,并能使药物对细菌生长抑制效果有足够时间得以体现,初步选定1x 105个/mL和1x106个/mL菌液密度进行药敏检测试验，以确定最适药敏检测接种密度。
1x105个/mL和1x106个/mL接种菌液在不同质量浓度链霉素条件下,阿尔玛蓝指示剂颜色随着时间延长呈现连续差异变化。其中，接种1x106个/mL菌液的药物阴性对照孔在8h后颜色由蓝色变为粉色,此时药物质量浓度≤3.2μg/mL的测试孔均变为粉色,其他测试孔变为紫色(图3);接种1x105个/mL菌液的药物阴性对照孔在12h后变为粉色,此时药物质量浓度≤1.6μg/mL的测试孔均变为粉色，其他测试孔均保持蓝色不变，且在此后4h时间孔内颜色未再发生变化(图4)。
在接种12h后，通过测定平行接种的无菌酶标板内的OD值,结果显示1x105个/mL和1x106个/mL接种菌液在3.2~25.6μg/mL药物质量浓度范围内细菌存活率均小于20%，具有显著抑菌效果，由此得出链霉素对迟钝爱德华氏菌的最小抑菌质量浓度为3.2μg/mL(表1)。将以上肉眼观察的颜色变化结果与细菌存活率结果比对发现,1*10^5个/mL接种菌液颜色判定最小抑菌浓度结果与细菌存活率判定结果一致,而与1x106个/mL接种菌液结果存在一定偏差，因此综合考虑药敏检测的准确性及肉眼可判性,选定快速药敏检测最适接种密度为1x105个/mL。
表1迟钝爱德华氏菌JF-1在不同质量浓度链霉素作用12h后的存活率%
| 接菌密度 个/mL | 药物质量浓度/μg·mL −1 | ||||||
| 25.6 | 12.8 | 6.4 | 3.2 | 1.6 | 0.8 | 0.4 | |
| 1x106 | 12.3 | 12.4 | 12.9 | 15.8 | 39.7 | 67.8 | 82.5 |
| 1×105 | 11.2 | 11.3 | 11.7 | 12.4 | 34.2 | 62.5 | 1 78.2 |
2.3阿尔玛蓝显色法测定迟钝爱德华氏菌JF-1对11种药物的敏感性结果
在制备的药敏检测板微孔内接种1*10^{5}个/mL菌液，培养12h后，阿尔玛蓝指示剂显色结果见图5。不同药物不同质量浓度对迟钝爱德华氏菌JF-1生长的呈现不同抑制作用,根据颜色指示可判定,氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平对迟钝爱德华氏菌的最小抑菌质量浓度分别为0.4、0.8、3.2、0.4、0.4、1.6、0.4、0.8、6.4、3.2、0.05μg/mL。
注:药物种类和质量浓度设置同图1.
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