大肠杆菌噬菌体Φ199一步生长曲线、与盐酸克林霉素体外联合应用效果（三）
2.3噬菌体Φ199一步生长曲线
如图4示，噬菌体Φ199在前5 min内效价无明显变化，5~10 min内效价急剧升高，然后趋于稳定。裂解量=裂解期平均噬菌斑数/潜伏期平均噬菌斑数。噬菌体Φ199的潜伏期为5 min，裂解期为5 min，裂解量为44。
(图4：噬菌体Φ199一步生长曲线)
2.4噬菌体Φ199体外裂解曲线测定
将噬菌体Φ199与宿主菌以最佳MOI混合培养并持续观察12 h，结果如图5所示。在前3 h内，噬菌体Φ199能够完全抑制大肠杆菌O157:H7的生长，未加噬菌体的大肠杆菌O157:H7则保持持续增长，空白对照组则未见细菌增长。
(图5：噬菌体Φ199体外裂解曲线)
2.5噬菌体Φ199热稳定性及pH稳定性
如图6所示，在40~60℃时噬菌体Φ199能够稳定存在，在70、80℃时噬菌体效价在1.5 h内急剧下降，在90℃孵育30 min后噬菌体效价降低至0。以上结果表明，噬菌体Φ199在40~60℃范围内活性比较稳定，在70℃及以上温度下较难长时间生存。
(图6：噬菌体Φ199温度敏感性)
(图7：噬菌体Φ199 pH值敏感性)
如图7所示，噬菌体Φ199在pH值为3~12时具有较好的活性，pH值为2和13时完全丧失活性。这些结果表明噬菌体Φ199对酸碱具有一定的耐受性，在pH值3~12时可以稳定存在。
2.6盐酸克林霉素的MIC值
通过将细菌与不同浓度抗生素共同孵育以探究大肠杆菌对盐酸克林霉素的MIC，结果盐酸克林霉素对大肠杆菌O157:H7的MIC为64μg/mL。
2.7噬菌体Φ199与盐酸克林霉素体外抗菌应用
将盐酸克林霉素与噬菌体Φ199体外联合应用，旨在探索二者联用效果。通过肉眼直接观察噬菌体与细菌联用后MIC的变化，结果如图8A所示。当噬菌体浓度为10^5 PFU/mL时，盐酸克林霉素的MIC仍为64μg/mL；噬菌体浓度为10^6 PFU/mL和10^7 PFU/mL时，抗生素的有效浓度降为1/2 MIC；当噬菌体浓度为10^8 PFU/mL时，抗生素的有效浓度降至1/4 MIC。
进一步检测细菌OD600 nm值并计算抗菌效率，图8B呈现了噬菌体与盐酸克林霉素联合应用的效果，数值代表细菌的清除效率，数值越大，颜色越浅，表明清除细菌的效果越好，其结果与图8A一致。
(图8：盐酸克林霉素与噬菌体Φ199联合应用的抗菌效果)
3讨论
本研究检测了以大肠杆菌O157:H7为宿主菌的噬菌体Φ199的生物学特性，并且噬菌体Φ199与盐酸克林霉素联用后能够降低大肠杆菌对盐酸克林霉素的MIC。噬菌体Φ199的生物学特性显示，其最佳MOI为1，能够在双层琼脂平板上形成清晰的噬菌斑。裂解曲线显示，噬菌体Φ199能够在3 h内达到良好的抑菌效果。通过透射电镜观察到噬菌体Φ199属于肌尾型噬菌体，具有直径约为50 nm的头部和长度约为100 nm的尾部。温度、酸碱度的变化能够影响噬菌体的生存和生产，作为一种生命体，噬菌体只有在活性良好的情况下才能够发挥理想的杀菌作用。通过检测噬菌体在不同温度和pH值条件下的生存能力显示，噬菌体Φ199在40~60℃范围内能够保持较高的活性，在pH值3~12范围具有较高的生物学活性，表明其能够在较宽的温度和酸碱环境下生存，证实该噬菌体具有良好的应用前景。
由于抗生素的滥用，导致临床上细菌耐药性问题严重，且由于超级细菌的形成导致采用单一抗生素或抗菌药物无法达到良好的治疗效果，因此在临床或试验中常使用多种抗菌药物联合抗菌。目前已有较多的研究报告显示，与单一噬菌体或抗生素相比，噬菌体与抗生素联用具有协同作用，可以避免细菌感染或生物被膜的形成。此外，越来越多的临床医疗者将噬菌体与抗生素联合应用以治疗多重耐药细菌感染引起的疾病，并且取得了较为显著的治疗效果。盐酸克林霉素具有广谱抗菌活性，主要通过与细菌核糖体的50S亚单位结合，抑制细菌肽链延长，从而抑制细菌蛋白质合成。盐酸克林霉素还可通过破坏细菌的表面结构和抑制细菌的生物活性来杀伤细菌，并有利于吞噬细胞的吞噬。
本研究显示，单独使用盐酸克林霉素时，盐酸克林霉素对大肠杆菌的MIC为64μg/mL，抗菌效果较差。单独使用噬菌体时，10^6~10^8 PFU/mL的噬菌体Φ199都无法在12 h内抑制大肠杆菌O157:H7的生长。联合用药后结果显示，在噬菌体浓度为10^6~10^7 PFU/mL时，能够将抗生素有效使用浓度降至1/2 MIC；在噬菌体浓度为10^8 PFU/mL时，能够使抗生素的有效使用浓度降至1/4 MIC，表明联合应用可以协同或增加药物的抗菌效果。有研究表明噬菌体与抗生素联用能够降低抗生素的使用浓度至1/2 MIC，而本试验降低抗生素使用浓度至1/4 MIC，显著提高了联用效果。这种联用效果的产生可能是由两方面因素导致的：一方面是细菌可能因为遗传限制使其无法高效产生2种抗菌机制的突变，并且抵抗不同抗菌机制之间可能存在相互负作用，即增强一种抵抗能力的同时会削弱另一种抵抗能力，且细菌荚膜对噬菌体的吸附十分重要，细菌可能通过丢失荚膜来改变噬菌体对其吸附能力，但是荚膜的丢失可能导致耐药细菌对抗生素重新敏感；另一方面，抗生素和噬菌体协同作用可能迅速降低了细菌密度，从而降低了耐药突变的概率。
综上，本研究发现了一种能够裂解大肠杆菌O157:H7的裂解性噬菌体Φ199，其与盐酸克林霉素联用后能够在体外有效抑制细菌生长，表明这种联用方法对于控制由耐药性大肠杆菌O157:H7引起的感染具有潜在的应用价值。然而，目前噬菌体与抗生素联用的方法仍然存在一些需要解决的问题：一方面是噬菌体可能与抗菌剂之间存在拮抗作用，导致联用后治疗效果低于抗生素治疗效果；另一方面是噬菌体与抗生素联用仍然可能导致细菌内毒素和毒性蛋白的释放，造成机体损伤。本试验没有检测噬菌体的耐药基因，以及联用后大肠杆菌O157:H7内毒素、志贺毒素等毒素物质的释放。相关试验表明，使用噬菌体和抗生素治疗时能够降低有毒物质的释放，提高对动物的治疗效果，且能够减少细菌耐药性的发展。相信随着研究的深入，以上问题将会得到解决，从而促进噬菌体-抗生素联合应用的发展和普及。