呼宁散对鸡肺源大肠杆菌生长曲线、细胞壁的影响及抑制效果——材料与方法
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株
鸡肺源大肠杆菌分离自鸡呼吸道疾病综合征患病肉鸡肺脏，于延边大学兽医药理学实验室保存。
1.1.2试验细胞
DF-1细胞购自上海富衡生物科技有限公司。
1.1.3试验药品
地骨皮、桑白皮、黄芩、党参、桔梗、茯苓、知母、玄参、蒲公英、甘草10味中药购自延吉市同仁堂大药房。
1.1.4主要试剂及仪器
碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒(A059-2-2)、活性氧(ROS)测定试剂盒(E004-1-1)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001-3-2)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)均购自南京建成生物工程研究所；脂多糖(LPS)购自Sigma公司；胎牛血清购自以色列BI公司；DMEM高糖培养基购自Gibco公司；青霉素、链霉素、PBS缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒(PC0020)均购自北京索莱宝生物科技有限公司；白细胞介素1β(IL-1β)检测试剂盒(MM-36910O1)、IL-6检测试剂盒(MM-0521O1)、IL-8检测试剂盒(MM-0768O1)均购自江苏酶免实业有限公司；一抗：兔TLR4(bs-20379R)、NF-κB p65(bs-0465R)、Keap1(bs-4900R)、Nrf2(bs-1074R)、NQO1(bs-2184R)、HO-1(bs-23397R)、GAPDH(bs-41373R)以及二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)(bs-40295G-HRP)均购自北京博奥森生物技术有限公司；T25培养瓶购自广州清风生化科技有限公司；CCK-8检测试剂盒(C0037)购自上海碧云天生物科技有限公司。37℃恒温箱购自Thermo公司；细胞培养箱C150型购自Binder公司；iMark酶标仪、电泳仪、PCR仪均购自Bio-Rad公司；台式高速离心机购自Sigma公司。
1.2试验方法
1.2.1中药复方呼宁散的制备
将地骨皮、桑白皮、黄芩、党参、桔梗、茯苓、知母、玄参、蒲公英、甘草按特定比例(桑白皮、黄芩、蒲公英、甘草质量份数5∶4∶3∶3，其他药味因专利保护未予公布)准确称量，加适量水浸泡30 min，煎煮30 min，滤出药液，药渣再煎煮30 min，合并药液，55℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥制成冻干粉，即为呼宁散。小量分装后置于-20℃保存。使用时称取适量冻干粉，按照试验所需浓度进行配制。
1.2.2牛津杯药敏试验
采用牛津杯法测定抑菌圈直径。将制备好的鸡肺源大肠杆菌菌液稀释至1×105 cfu·mL-1，涂布于LB琼脂平板。以庆大霉素药敏纸片和无菌水为对照，无菌操作向牛津杯中注入0.1 mL(1 g·mL-1)呼宁散，37℃培养24 h，测抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感，10~19 mm为中度敏感，＜10 mm或无抑菌圈为不敏感。
1.2.3 MIC和MBC的测定
采用2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的MIC。从混合液澄清的各孔依次吸取100μL培养物接种到固体培养基上培养，以菌落数小于5个视为无菌生长，以无菌生长的药物最低浓度作为呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的MBC。
1.2.4细菌生长曲线的测定
将鸡肺源大肠杆菌悬液调整至1×105 CFU·mL-1，加入呼宁散溶液，使其终浓度为和1/2 MIC和MIC，37℃培养，630 nm处测定吸光值，根据培养时间和吸光值绘制细菌生长曲线。
1.2.5菌液中AKP含量的测定
按“1.2.4”进行分组，37℃、180 r·min-1条件下培养12 h，每隔6 h取等量菌液，4 500 r·min-1离心15 min，取上清，根据AKP检测试剂盒说明书测定菌液上清中AKP的含量。
1.2.6菌液中可溶性蛋白和核酸含量的测定
按“1.2.4”进行分组，37℃、180 r·min-1条件下培养12 h，每隔6 h取等量菌液，4 500 r·min-1离心15 min，取上清：(1)检测培养液中的可溶性蛋白含量变化，按BCA蛋白定量测定方法测定蛋白浓度；(2)检测培养液中的核酸含量变化，待测上清液于260 nm处测定吸光值。
1.2.7 LPS及呼宁散对DF-1细胞的毒性试验
将生长状态良好的DF-1细胞调整至浓度为5×104个·mL-1,以每孔100μL接种于96孔板，培养24 h，PBS洗涤细胞3次。(1)加入含有0、10、20、30、40μg·mL-1 LPS的DMEM培养基，继续培养24 h。(2)在另一块含有细胞的96孔中加入含有0、1、1.5、2、2.5、3、4 mg·mL-1呼宁散的DMEM完全培养基，继续培养24 h。LPS及呼宁散处理结束后每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续培养1.5 h，用酶标仪检测450 nm处OD值。
1.2.8细胞试验分组与给药
将生长状态良好的DF-1细胞调整至浓度为5×104个·mL-1，分为空白组、LPS组、呼宁散剂量组(低、中、高)。空白组：DF-1细胞培养24 h贴壁后，后续每24 h更换一次完全培养基；LPS组：DF-1细胞培养24 h贴壁后，先更换完全培养基培养24 h，再换成含有40μg·mL-1 LPS的完全培养基；呼宁散组：DF-1细胞培养24 h贴壁后，分别换成含有1.5、2、2.5 mg·mL-1呼宁散的完全培养基预处理1 h，之后加40μg·mL-1 LPS的完全培养基。
1.2.9 ELISA法测定相关炎症因子含量
各组细胞给药及培养24 h后，收集上清培养液，根据相应ELISA试剂盒说明书测定上清液中的IL-1β、IL-6、IL-8含量。
1.2.10氧化应激指标和抗氧化物含量的测定
收集上述各试验组DF-1细胞，提取细胞总蛋白，按照ROS、MDA、SOD、GSH试剂盒说明书指导测定各指标。
1.2.11 Western blot法测定细胞TLR4/NF-κB炎症通路及Keap1/Nrf2氧化通路关键蛋白的表达
各组细胞给药及培养24 h后，RIPA法提取细胞总蛋白及核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白统一定量后进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜。TBST洗膜，5%脱脂乳中封闭1 h。TBST洗膜，分别加入一抗兔抗TLR4、NF-κB p65、Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1及内参GAPDH抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜，加入二抗羊抗兔IgG H&L(HRP)抗体室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL显色，拍照，Image J软件进行灰度分析。
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