牛病毒性腹泻病毒BVDV在MDBK细胞上一步生长曲线
牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，主要以口腔、食管、胃、肠等部位黏膜侵蚀性或溃疡性病变、腹泻、白细胞减少、持续性感染及怀孕母牛流产或产畸形胎儿等症状为特征[1-2]。BVDV在世界范围内广泛流行，给养牛业国家造成严重的经济损失[3]。犊牛感染BVDV后，潜伏期7～9 d，发病率为2%～5%，犊牛死亡率可达90%。妊娠母牛在妊娠30～120 d间感染后可产持续性感染牛，持续性感染牛可持续排毒成为BVDV重要的传染源，是饲养场无法根除BVDV的重要原因之一。通过检测并淘汰持续性感染牛，是逐步实现BVDV净化的重要手段。
牛病毒性腹泻病毒感染是危害养牛业的重要疾病，开发检测和诊断牛病毒性腹泻的快速诊断技术对牛病毒性腹泻的防控及净化、推动养牛业健康发展具有重要的意义。为了预防与控制牛病毒性腹泻病毒感染，科研人员建立了诸多分子生物学诊断方法。应用地高辛、生物素等标记物标记核酸探针，建立核酸杂交检测方法，快速、简便、经济地检测BVDV[8]。白泉阳等[10]、宋爽等针对BVDV保守的5’UTR设计引物和探针，建立Taqman荧光定量PCR方法，方便、快速地检测BVDV，该方法敏感度高、重复性好。
表1 BVDV RT-qPCR重复试验结果
图4 BVDV在MDBK细胞上一步生长曲线
荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性高、敏感性高、重复性好、可实时定量等特点。实时荧光定量PCR包括探针法和染料法，其中染料法相对探针法价格更低。目前荧光定量PCR已经成为实验室快速检测和诊断病原的重要手段[12]。对于非致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒在培养细胞上不产生细胞病变，通过间接免疫荧光试验或间接免疫过氧化物酶试验测定接毒后不同时间点收获病毒的TCID50，进而绘制非致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒在培养细胞上的生长动力学曲线，此种测定方法耗力费时。而应用荧光定量PCR方法可快速定量地对病毒基因组进行检测，因此本试验将荧光定量PCR方法应用于BVDV一步生长曲线的绘制中。
为了实现测定BVDV NCP型一步生长曲线，本试验根据牛病毒性腹泻病毒5’UTR保守序列设计荧光定量PCR引物，建立了检测牛病毒性腹泻病毒的SYBR Green荧光定量PCR方法并将该方法应用于BVDV一步生长曲线的测定中。研究中所建立的SYBR Green荧光定量PCR方法具有良好的重复性和敏感性，但其存在不能特异性鉴别BVDV与猪瘟病毒的缺陷。这一缺陷，可根据瘟病毒属成员5’UTR序列中的差异序列区设计特异性的探针，以改善荧光定量PCR方法的特异性。该方法的建立和应用，为研究非致细胞病变型BVDV分离毒株的生长特性的研究提供了一定的参考。