不同乙醇、乙酸、氯化钠、浓度对小米醋发酵过程中醋酸菌生长曲线的影响（二）
1.2仪器与设备
DL-CJ-2 ND1超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司;KG-SX-700立式压力蒸汽灭菌锅，上海莱睿科学仪器有限公司;CX23光学显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司;HWS-250B电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司;XJ220A-SCS电子分析天平，上海天美天平仪器有限公司;LPH-A pH计，北京兰杰柯科技有限公司;TU1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析仪器厂。
1.3实验方法
1.3.1分离筛选
称取10g醋醅或10mL醋样，置于含有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，于30℃、150r/min充分振荡30min。取1mL菌悬液装入含有9mL无菌生理盐水的试管中进行梯度稀释。将各梯度(10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷)溶液吸取0.2mL涂布于分离培养基平板中，于30℃恒温培养箱中倒置培养2~3d。培养结束后，挑选出变色圈清晰且生长良好的单菌落进行2~3次分离纯化。对符合条件的单菌落进行编号，挑选菌落形态一致的单菌落转移到斜面培养基上，于4℃冰箱中保存备用。同时将纯化后的醋酸菌与30%甘油1:1(体积比)混合，存放在2mL的EP管中，保存于-80℃冰箱。
1.3.2形态特征
1.3.2.1菌落形态
将筛选菌株划线于分离培养基平板，30℃培养48h后，观察并记录单菌落特征，包括透明度、颜色、表面情况、边缘状态以及外观形状。
1.3.2.2细胞形态
在分离纯化后，将待观察的菌株进行革兰氏染色，放置在显微镜下，观察菌体细胞形态和大小。
1.3.3生理生化实验
生理生化实验参照冯荆舒的方法。
1.3.4醋酸菌特性研究
1.3.4.1定性实验
将斜面保存的菌种进行2次活化后，接种到装有100mL发酵培养基的三角瓶中，于30℃、150r/min的振荡培养箱中振荡培养72h后吸取10mL发酵培养液至离心管中，于5000r/min的转速离心10min后取出5mL培养液置于小烧杯中。用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH7.0，然后滴加4~5滴50g/L的FeCl₃溶液。若水浴加热5min后出现红褐色沉淀，则为醋酸菌。
1.3.4.2定量实验
将斜面保藏菌株接种于50mL液体培养基中，30℃，150r/min振荡培养36h后取菌液5mL接种于50mL发酵培养基中，30℃，150r/min振荡培养5d，产酸量测定参照GB12456-2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》方法。
1.3.5醋酸菌耐受性研究
将3%、5%、7%、9%、11%(体积分数)的无水乙醇;2、4、6、8、10 g/L的氯化钠;1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%(体积分数)的乙酸接入到100mL发酵培养基中，按10%(体积分数)的接种量接入菌悬液，于30℃、150 r/min摇床培养，每隔12h测定OD₆₀₀值和产酸量，直至稳定，每个菌种3次重复。
1.3.6生长曲线测定
将前期筛选出来的优良菌株活化接种于液体培养基中，于30℃、150r/min振荡培养箱中培养。每隔12h取一次样，利用分光光度计测定其OD₆₀₀值，同时将10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷的活化菌液吸取0.5mL均匀涂布至醋酸菌分离培养基平板，于28℃恒温培养箱培养，测定其活菌数，每个菌种3次重复。
1.3.7分子生物学鉴定
将筛选出来的优良菌株进行测序，测序引物选用细菌16S rDNA的通用引物27F和1492R。测序结果在NCBI数据库中检索与目标菌株具有较大同源性的菌种做分析比较，采用MEGA11.0软件进行多序列比对，并采用邻位相连法构建系统发育树。
1.4数据分析
本实验采集3个平行样，利用Excel、Orgrain软件进行数据处理和作图，数据表示为“平均值±标准差”。
2结果与分析
图1醋酸菌菌落及细胞形态
2.1菌落及细胞形态
从小米醋醋液、醋醅中分离得到24株具有典型醋酸菌特征的菌株。分别命名为SY01、SY02、SY03、RH04、RH05、SH06、YH07、YH08、GL09、GL10、GL11、XM12、XM13、GL14、SY15、GL16、GL17、GL18、GL19、XM20、SZ21、RH22、XM23、XM24。细胞形态主要为椭圆状、短杆状。典型醋酸菌落及细胞形态见图1。
注:标尺为3mm;放大倍数100x。