AEG-1促进肝癌生长与定向肺转移的作用与机制研究（四）
2.4 AEG-1与肝癌细胞肺转移
肉眼观察皮下移植瘤模型肺组织均无异常表现;HE染色组织学检查发现，SMMC-7721-AEG-1-L组存在2个肺转移灶，SMMC-7721-control-L组未见肺部转移灶;SMMC-7721-shAEG-1-P组未见肺转移灶，SMMC-7721-control-P组肺部有1处转移灶(图8)。肝内原位移植瘤裸鼠活体成像中均未看到肺部出现发光(图6);但是光学显微镜组织学检查发现，SMMC-7721-AEG-1-L组、SMMC-7721-control-L组肺部转移灶分别为3个、1个;SMMC-7721-shAEG-1-P组未发现肺部转移灶，SMMC-7721-control-P组肺部存在2个转移灶(图9)。
裸鼠肝癌细胞血行播散模型，以每只 5\times 10^6 的细胞数尾静脉注射SMMC-7721-AEG-1-L、SMMC-7721-control-L、SMMC-7721-shAEG-1-P和 SMMC-7721-control-P肝癌细胞。尾静脉注射35d后活体成像未观测到肺部发光转移灶，第60天后再次行活体成像发现肺转移率分别是:SMMC-7721-AEG-1-L组60%、SMMC-7721-control-L组20%;SMMC-7721-shAEG-1-P组 20%、SMMC-7721-control-P组60%。图10显示各组典型肺部转移结果，SMMC-7721-AEG-1-L组的肺右上叶和左侧三叶出现大片发光癌灶，SMMC-7721-control-L组大约在右肺门的位置检测到1处发光癌灶;SMMC-7721-shAEG-1-P组在左肺下叶有1处发光癌灶，SMMC-7721-control-P组全肺出现弥散性癌灶。裸鼠于尾静脉注射后的60d给予处死，取肺组织。肉眼可见SMMC-7721-control-P组裸鼠肺表面有满肺转移微小点状癌灶，其余3组肺表面未见异常。取部分肺组织石蜡包埋HE染色，光学显微镜下进行观测:SMMC-7721-AEG-1-L组转移灶有18个，SMMC-7721-control-L组有3个转移灶;SMMC-7721-shAEG-1-P组转移灶为5个，SMMC-7721-control-P组转移灶有23个(图11)。
图10裸鼠肝癌细胞血行播散模型肺转移活体成像
图11血行播散模型肝癌细胞肺转移(HE染色)
3讨论
肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升，病死率居我国恶性肿瘤的第2位，死亡原因大多与侵袭转移有关。因此，有效地减少或阻断肝癌细胞的转移是当前研究的重点之一。
原发性肝癌的远处转移多以血行播撒为主，尤以肺转移最为常见。研究表明循环肿瘤细胞从原发部位肿瘤组织脱落进入血流，启动远端转移过程，而循环肿瘤细胞向靶器官微血管内皮细胞趋化是前期准备和必要条件。我们前期研究观察到，在Transwell小室下层铺有一层人肺微血管内皮细胞(HPMECs)及人脐静脉微血管内皮细胞(HU-VECs)，发现肝癌细胞株更易向铺有HPMECs的小室趋化。这一实验提示，肝癌细胞转移可能更易向肺转移。那么，是什么因素调控了肝癌细胞向肺微血管内皮细胞趋化呢?
研究表明，AEG-1基因在多种肿瘤中高表达，如非小细胞性肺癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌等,AEG-1基因的高表达与肿瘤细胞增殖、凋亡、耐药等密切相关，这些研究表明，AEG-1在肿瘤的发生发展、侵袭转移中起重要作用。在体内实验中，使用裸鼠异种移植模型，人类肝癌细胞中AEG-1的过表达导致形成了具高度侵袭性、血管生成性和转移性的肿瘤，而AEG-1的表达抑制减缓了肝癌的发展。我们前期研究发现,抑制肝癌细胞AEG-1可影响骨架蛋白F-actin表达,肝癌细胞骨架重排,有可能减少肝癌侵袭转移。AEG-1在癌症的炎症机制中起关键的作用,有研究发现AEG-1可通过NF-kB的活化促进肝癌发展。
本研究小组及近期研究显示，AEG-1与肝脏炎症密切相关。本研究在皮下移植瘤、原位移植瘤模型中观察到AEG-1高表达可增加肝内转移的同时伴有肝脏的炎症浸润。而AEG-1在人类炎症及纤维化发生等多条信号转导通路中发挥重要作用,可调控PI3K/Akt、p38 MAPK、ERK等通路，我们在后期的分子研究中可检测相关信号通路的变化，为进一步研究肝癌侵袭转移提供实验依据。
本研究选择低侵袭性成瘤率较高的SMMC 7721肝癌细胞构建AEG-1过表达或沉默的SMMC-7721肝癌细胞株，而后使用荧光素酶基因慢病毒载体转染上述肝癌细胞用于动物活体成像。本研究建立皮下移植瘤模型测量皮下肿瘤体积，观测AEG-1过表达/沉默与肿瘤生长的关系。结果显示SMMC-7721-AEG-1-L组的肿瘤体积和生长速度显著增加。
肝内原位移植瘤模型模拟人原发肝细胞癌，使用较为直观的动物活体成像的方法来检测原发肝癌中AEG-1基因表达在肿瘤肝内转移中所起的作用。原位移植瘤模型中，SMMC-7721-AEG-1-L组肝内有明显发光转移灶，SMMC-7721-shAEG-1-P组的肝脏肿瘤发光范围较小且没有发光转移灶。
血行播散裸鼠模型的活体成像结果显示AEG-1过表达导致肺转移灶发光范围及强度显著增加。相反，沉默AEG-1则导致肺转移灶发光范围及强度显著降低,本研究结果与Bhatnagar等在前列腺癌中的研究结果一致。HE染色检测裸鼠血行播散模型的肺转移结果显示,AEG-1过表达/沉默导致肺转移灶数量显著增多/减少。以上研究结果与头颈部鳞状细胞癌中的研究一致,表明AEG-1高表达具有促进肝癌细胞肺转移的作用。
综上所述，AEG-1基因过表达具有促进肝癌的生长以及肝内、肝外侵袭转移的作用，反之沉默AEG-1基因则可以抑制肝癌细胞的生长和肺转移。本研究为进一步探讨肝癌肺转移定向趋化的分子机制奠定了实验基础。
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