转录水平解析昆虫病原线虫共生菌菌株新型杀菌蛋白PPIA-L20基因表达调控——摘要、引言
[目的]前期从广谱抗菌的Xenorhabdus bovienii NN6菌株的胞外蛋白中分离出一种新型杀菌蛋白PPIA-L20，为肽基脯氨酰异构酶A类似物，该蛋白能够抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型的孢子的萌发，致使孢子死亡。经过多次试验验证ppia-l20 基因的表达水平不稳定，与发酵时间没有明显的相关性。本文旨在探寻调控ppia-l20基因表达的调控因子，进而推测ppia-l20基因表达调控的分子机制，为进一步提高抗菌蛋白的产量提供参考。[方法]对ppia-l20的转录水平进行Real-time PCR分析并与菌株生长曲线进行相关性分析，选择ppia-l20基因表达量差异显著的2个发酵时间点进行转录组学比较，并对表达差异显著的DEG(differential expressed gene)进行GO功能注释、KEGG富集通路和蛋白网络互作分析。[结果]4～84 h发酵菌体中的ppia-l20基因表达趋势不稳定，其转录水平与时间不相关。与ppia-l20低表达量的8 h发酵菌体相比，ppia-l20高表达量的12 h发酵菌体中有466个DEG，包括193个上调基因和273个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致，证明测序结果可信。对差异表达的基因进行GO功能注释、KEGG富集分析，发现DEG的功能与膜形成相关，富集通路与双组分调节系统、磷酸转移酶系统和阳离子抗菌肽抵制通路相关。其中，双组分调节系统中的qseC基因和opmR基因表达量均上调2倍，ppia-l20基因位于阳离子抗菌肽抵制通路，该通路上的nlpE基因(负责编码外膜脂蛋白)显著下调。蛋白互作网络中，PPIA-L20蛋白与位于外膜的AMP结合蛋白TycC、GrsB有互作关系，NlpE蛋白与双组分调节系统中cpxR基因、cpxA基因表达的蛋白有互作关系。[结论]Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能通过双组分调节系统通路、阳离子抗菌肽抵制通路上的关键基因nlpE和磷酸转移酶系统共同调控ppia-l20的表达。
引言
昆虫病原线虫共生菌(entomopathogenic nematode symbiotic bacteria)是一类与昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode，EPN)共生的细菌，包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆菌属(Photorhabdus)及沙雷氏菌属(Serratia)的部分种。由于该类共生菌能够产生多种杀虫及抑菌活性物质，已成为植物病虫害生物防治的重要资源。目前已分离纯化得到的抑菌产物多数来源于Xenorhabdus属昆虫病原线虫共生菌，如吲哚类化合物、水溶性小肽类抗菌化合物(xenocoumacin1，XCN1)、二硫吡咯酮类、蒽醌类、呋喃酮类和抗菌肽等小分子物质，以及蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、DNA酶和几丁质酶等大分子物质。Gualtieri等从Xenorhabdus nematophila F1菌株中分离出富含赖氨酸的PAX肽类，其中PAX1-5对植物病原菌和人类条件病菌尖孢镰刀菌有抑制作用。Xiao等从Xenorhabdus budapestensis NMC-10分离出2种抗菌肽GP-19和EP-20，对辣椒疫霉和辣椒黄萎病有较强的抑制效果。Chen等发现嗜线虫Xenenorhabdus nematophilus和Xenorhabdus bovienii能够产生胞外几丁质酶和胞内几丁质酶用于杀虫活性。细菌产生的杀虫及抑菌活性毒力因子受到多种信号转导系统的调控，信号转导系统用于调节生理活动、毒力、耐药性等，其中细菌双组分调节系统(two-component system，TCS)是微生物感知和响应外部和/或膜内刺激的主要机制。TCS不仅参与调控毒力因子产生，而且还调节抗生素耐药性的基因表达。目前，关于Xenorhabdus属抗菌蛋白表达调控的研究较少。
本课题组前期从1株广谱抗菌的Xenorhabdus属昆虫病原线虫共生菌菌株X.bovienii NN6的胞外蛋白中，分离纯化得到1种新型杀菌蛋白PPIA-L20，为肽基脯氨酰异构酶 A 类似物，该蛋白不仅在较低剂量就能致死尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariurn oxysporum f. sp. niveum，FON)的孢子，而且对FON菌丝生长也有显著的抑制效率。PPIA-L20是首次发现的具有杀菌作用的肽基脯氨酰异构酶 A 类似物，其基因表达调控机制尚不清楚。本研究利用转录组测序技术和实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR)，对该基因表达情况和调控机制进行探究，尝试从转录水平对抗菌蛋白表达调控进行解析，为其作为生防制剂的开发提供理论依据。
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