3讨论与结论

本课题组前期从Xenorhabdus bovienii NN6菌株胞外蛋白中分离出一种抑菌蛋白PPIA-L20，为肽基脯氨酰异构酶A类似物，该蛋白对镰刀菌属真菌具有极强的抑制效果。本研究发现ppia-l20基因表达水平不随发酵时间变化而变化，与发酵时间没有相关性，而胞外抗菌蛋白浓度随发酵时间增加而增加。采用转录组测序技术发现，基因ppia-l20在不同表达水平情况下，差异表达基因主要涉及细胞膜相关功能、次级代谢产物合成、氨基酸合成、双组分调节系统和鞭毛合成相关通路。这表明ppia-l20表达受到多种生物途径的共同调节，在发酵过程中呈现动态表达现象。

在本研究中，GO分析结果显示差异基因主要归属于代谢过程、定位、膜等功能分类。KEGG富集通路预测结果与次级代谢产物合成、双组分调节系统相关通路、鞭毛组装与磷酸转移酶系统通路相关。肠杆菌科中，阳离子抗菌肽能够激活磷酸传导系统中rcsB基因，激活信号传递给下游的ppia-l20，激活相关基因表达并辅助蛋白折叠进行膜修饰等一系列应激反应以抵御抗菌肽的侵袭。本研究中，KEGG富集基因位于双组分调节系统通路中，磷酸传导系统中rcsB基因激活，双组分调节系统通路中的关键基因ompR显著上调，kdpc、kdpB作为反应调节因子显著上调。在鼠伤寒杆菌中，磷酸传导系统PhoPQ通过促进PmrD蛋白的表达来控制PmrAB信号，PmrD蛋白与磷酸化的PmrA结合并阻止去磷酸化，导致PmrA调控基因的激活。PhoQ结构与功能息息相关，PhoQ的阴离子结合位点朝向内膜，其位置有利于与膜表面的阳离子AMPs相互作用。AMPs可能被位于内膜(IM)内部脂蛋白感知，从而导致rcsBCD激活，其机制尚不清楚。本研究中，双组分调节系统相关基因和磷酸转移系统rcsB基因的激活，可能与外部环境中的阳离子抗菌肽刺激相关。DEG富集通路包括双组分调节系统相关通路和磷酸转移酶系统，细菌双组分系统通过磷酸化级联反应，通过传感器激酶和反应调节因子NlpE蛋白控制基因表达，帮助维持革兰氏阴性细菌外膜(OM)完整性。这与GO分析中的细胞膜功能相关蛋白的表达相吻合。本研究结果表明，nlpE基因显著下调，NlpE蛋白同时存在于PPIA-L20蛋白共同通路(阳离子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到调控ppia-l20基因表达的作用。

鞭毛分泌系统的基因普遍下调，主要调控鞭毛调节器flhDC在运动协调中的作用，在嗜线虫致病杆菌X.nematophilila中，反应调节基因ompR或同源组氨酸激酶基因envZ失活后，抗生素产生和位于鞭毛基因簇附近的nrps1基因的表达水平均升高。ompR/envZ在抗菌物质和毒力因子产生过程中起到负向调控的作用。已有研究证明，在嗜线虫致病杆菌X.nematophilila中，细菌素复合体等外泌蛋白通过鞭毛Ⅲ型分泌系统(T3SS)输出，鞭毛转录调节因子也可以通过调节毒力因子的表达来促进毒力的发挥，鞭毛转录调节因子fliZ能够直接或间接上调编码杀虫毒素和抗菌化合物(XcnA-N、PaxABCT)的基因的表达。本研究中，fliZ基因显著下调，与ompR/envZ基因显著上调共同调控抗菌蛋白基因的表达结果一致。通过构建蛋白互作网络发现，与ppia-l20基因位于共同通路上的nlpE基因表达蛋白与双组分调节系统中cpxR基因表达蛋白具有互作关系，cpxR基因位于ppia-l20基因上游，与磷酸传导系统中rcsB基因起到共同调控的作用。

综上所述，ppia-l20基因表达可能受到阳离子抗菌肽抵制通路中的关键蛋白NlpE脂蛋白以及双组分调节系统和磷酸转移系统共同调节。ppia-l20基因表达的抗真菌蛋白有巨大的开发价值，同时该基因在菌株受到外界抗生素刺激时也发挥重要作用。本研究首次对ppia-l20基因不同表达水平下的Xenorhabdus bovienii菌株进行转录组测序，分析了可能影响ppia-l20基因表达水平相关的通路，以及ppia-l20基因不同表达水平下相关差异表达基因的变化趋势与其功能之间的关系，为进一步探索基因表达调控机制提供参考，并为高效开发抗真菌生防制剂奠定理论基础。

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