DAPI荧光染色计数法：不同保藏方式时间对海洋微型底栖生物计数结果的影响——结果、结论
2结果
2.1站位基本情况
实验中5个站位(3205、3403、4018、3400-8、3800-1)的环境因子见表1。
表1五个站位3205、3403、4018、3400-8、3800-1的环境因子
图2 DAPI染色后的细菌(2-1)、硅藻(2-2,2-3)、鞭毛虫(2-4～2-7)及蓝细菌(2-8)
2.2保藏方式实验
利用DAPI染色,对三站位(3205、3403、4018)0～2 cm分层的冷冻、冷藏样品进行分析。荧光镜检观察到细菌及各种原生生物的形态如图2所示,细菌大小约为1～2µm,常见为球菌、杆菌、弧形菌;硅藻种类多样,有圆筛藻、曲舟藻、直链藻等,常见10µm大小的直链藻;鞭毛虫形态多种多样,有球形,椭球形等,个体大小差异也较大;蓝细菌多为2个或4个一组存在。
图3示3205、3403、4018站冷冻、冷藏两种保藏方式下各类群的丰度。三个站位冷冻样品中细菌平均丰度为8.69×108±2.92×108个/mL,较冷藏样品低25%(平均1.16×109±0.31×109个/mL),2～5µm的鞭毛虫平均丰度为4.00×106±0.97×106个/mL,较冷藏样品低25%(平均5.39×106±1.92×106个/mL),5～10µm的鞭毛虫平均丰度为5.07×105±3.06×105个/mL,较冷藏样品低23%(平均6.61×105±3.06×105个/mL),＞10µm的鞭毛虫平均丰度为4.50×104±4.82×104个/mL,较冷藏样品低79%(平均2.18×105±1.38×105个/mL),硅藻平均丰度为8.35×104±7.71×104个/mL,较冷藏样品低13%(平均9.63×104±13.9×104个/mL),蓝细菌平均丰度为2.56×106±0.75×106个/mL,较冷藏样品高9%(平均2.35×106±0.86×106个/mL)。沉积物中细菌在丰度(108～109)上占绝对优势(冷藏冷冻样品98.84%～99.35%),冷藏保存下4018站的细菌丰度最高;其次是自养小鞭毛虫(丰度占0.32%～0.57%)、蓝细菌(丰度占0.12%～0.40%)、异养小鞭毛虫(丰度占0.02%～0.25%),硅藻丰度所占比例最小(0～0.02%)。三个站位沉积物样品中相同粒级的自养小鞭毛虫的丰度均高于异养小鞭毛虫。自养小鞭毛虫丰度4018站最高,其次是3403站、3205站。按鞭毛虫大小看,2～5µm鞭毛虫的丰度最高,5～10µm鞭毛虫丰度次之,＞10µm鞭毛虫丰度最小。
T-test检验结果表明,冷冻、冷藏两种保藏方式下,3205站和3403站的各测试对象：细菌、硅藻、蓝细菌、自养小鞭毛虫、异养小鞭毛虫均无差异;4018站的细菌、硅藻、蓝细菌、异养小鞭毛虫及PNF(＞10µm)均无差异,而PNF(2～5µm)、PNF(5～10µm)存在显著差异(P＜0.05),PNF(2～5µm)冷藏样品丰度显著高于冷冻样品92.1%,PNF(5～10µm)冷藏样品丰度显著高于冷冻样品89.5%(表2)。
图3冷冻及冷藏两种保藏方式下3个站位(3205、3403、4018)的细菌(a)、硅藻(b)、蓝细菌(c)、自养小鞭毛虫(d)和异养小鞭毛虫(e)的丰度
2.3保藏时间实验
为研究不同保藏时间对细菌及各原生生物类群定量计数的影响,对来自黄海的两个站位(3400-8及3800-1)0～2 cm及2～5 cm分层的样品经保存1个月和4个月后的对比分析见表3。两个站位的各类群中,细菌丰度均超过99%,自养小鞭毛虫占0.42%,异养小鞭毛虫、蓝细菌,硅藻所占比例最小。在保存1个月和4个月后各类群所占的百分比基本保持稳定。统计分析表明,不同保存时间下,3400-8及3800-1站的两个分层的细菌、蓝细菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)和硅藻均无差异。3400-8站两个分层的HNF(2～5μm)均有显著差异,保存4个月后镜检均未检获到;而PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均无差异。3800-1站0～2 cm分层的PNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)均有显著差异,保存4个月后PNF(2～5μm)的丰度比1个月时减少了47.4%,HNF(5～10μm)未检获到;2～5 cm分层的PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)均有显著差异,保存4个月后PNF(2～5μm)丰度比1个月时减少了59.6%,HNF(2～5μm)未检获到(表3和表4)。
表2不同保藏方式下3205、3403、4018站位的0~2cm分层细菌,蓝细菌及原生生物的T-Test检验
3讨论
3.1保藏方式对定量的影响
Porter等报道福尔马林固定后的浮游样品经DAPI染色封片后,4℃保存24周,细菌计数结果无差异。Hyun等研究发现浮游样品采集后经福尔马林固定,一部分存于样品瓶中,一部分现场染色封片,均冷冻保存90天。结果显示存于样品瓶后的细菌数量为原来的95%,而封片中细菌数量为原来的80%,且反复冻融可造成细菌数量损失。但有关底栖样品保藏后对实验结果的影响研究极少。本研究三个站位中,对于细菌、蓝细菌、硅藻、三个粒级的异养小鞭毛虫以及大于10µm的自养小鞭毛虫,冷冻、冷藏两种保藏方式无差异;而对于2～5µm与5～10µm的自养小鞭毛虫来说,在一个站位呈现差异显著,冷藏获得的丰度高于冷冻保藏。原因可能在于冷冻样品的解冻过程对细胞尤其是较大个体的细胞造成破碎,解冻对于细胞壁较为坚实的细菌和蓝细菌的影响较小,而对于细胞壁不太坚实的鞭毛虫则影响较大。因此,对沉积物样品短期内宜采用避光冷藏保存。此外,沉积物类型的不同,也会对定量计数造成影响：例如,含砂量较多的样品过滤到黑膜上后,可造成细胞分布不均或镜检时焦距不同而影响计数,而含泥较多则会遮掩部分细菌及小的原生生物。
表3两站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分层样品在保存1个月和4个月后的细菌、蓝细菌及原生生物的丰度
表4两站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分层在保存1个月和4个月后的细菌及原生生物的T-Test检验结果
3.2样品保存时间对定量的影响
在样品保存时间对底栖生物定量分析的影响方面,迄今尚无研究报道。Daley等、Sherr等及Kepner等发现经福尔马林固定的浮游样品于5℃下避光保存1～2周后,对细菌的计数结果无差异。Turley曾报道经戊二醛固定后的浮游样品常温避光保藏,前40天内细胞数量平均减少39%,并证实无论以何种固定液(戊二醛或甲醛)、样品瓶(无色或棕色瓶)或染色剂(AO或DAPI)处理,均会造成细胞数量的低估。本研究表明样品随着保存时间的延长(保藏1个月和4个月),对其定量计数依不同研究对象而有程度不同的影响：对于细菌、蓝细菌、PNF(5～10μm)、PNF(＞10μm)、HNF(＞10μm)、硅藻保存4个月后计数无影响;而对于PNF(2～5μm)、HNF(2～5μm)、HNF(5～10μm)的影响不同,例如样品保存4个月后,在3800-1站0～2 cm分层的PNF(2～5μm)丰度比1个月时减少了47.4%,2～5 cm分层的丰度减少了59.6%,而且统计分析存在差异的HNF(2～5μm)和HNF(5～10μm)在4个月后丰度降为0。可见样品保藏时间对异养小鞭毛虫的影响比自养小鞭毛虫的影响大。总体上,样品保藏4个月对细菌、蓝细菌、硅藻均无影响,但对鞭毛虫有一定的影响,因此建议对鞭毛虫样品在采集后宜尽快分析。
4结语
冷冻和冷藏两种保藏方式对于细菌、蓝细菌和硅藻的影响未呈现明显差异,但对于自养小鞭毛虫则冷藏优于冷冻方式,故建议短期内对沉积物样品采取避光冷藏保存,并在采集后尽快完成样品的定量分析。
致谢：本研究样品源于“中国科学院海洋研究所2007年度黄海冷水团调查航次”。杜永芬、代仁海、詹子锋协助采样,李承春协助部分样品处理,在此一并致谢。
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