芽胞杆菌合成次级代谢产物Surfactin肽段分类地位及促生功能
Surfactin是芽胞杆菌合成的次级代谢产物，由7个α-氨基酸残基的环短肽与链长为12-17个碳原子的β-羟基脂肪酸通过内酯键交联组成的环状物质。Surfactin家族典型的头部氨基酸顺序为：L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6-L-Leu7。根据第7位氨基酸的类型，surfactin分为A（L-Leu）、B（L-Val）和C（L-Ile）三种类型，每种类型因脂肪酸肽链长度不同形成同系物。两个带负电荷的氨基酸残基Glu和Asp为极性亲水部位，其他氨基酸残基和脂肪酸链组成疏水结构域，这种结构决定了surfactin具有两亲性和极高的表面活性。
浓度为40 mg/L的surfactin可以将水的表面张力从72 mN/m降低到27 mN/m。这优越的表面活性和复杂的结构类型赋予surfactin多样的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗炎、溶栓、抗支原体、抗高胆固醇、抗病毒、抗癌和对胰岛素抗性的改善等，使surfactin广泛应用于医药、化工、食品、农业和环境治理等领域。Surfactin通过损伤病原菌细胞膜引起细胞膜裂解或渗透压失衡、抑制病原菌繁殖、诱导植株系统抗性和促进生防菌株的定殖或生物膜形成等广泛应用于植物促生和生物防治。
前人研究发现番茄细菌性溃疡病生防菌株B.velezensis 1B-23和Bacillus spp.1D-12产生的脂肽C13-surfactins A、C14-surfactins A和C15-surfactins A均能抑制病原菌Clavibactermichigan sub（Cmm98-1）的生长。B.velezensis MS20菌株产生的surfactin具有抑制立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌丝生长的特性，用surfactin处理感染了R.solani的玉米植株，能有效降低玉米纹枯病的发病率，经检测抗性玉米植株细胞产生的防御酶含量相对提高，说明surfactin诱导了玉米植株的系统性抗性。从B.pumilus W-7菌株发酵液提取的surfactins和fengycin B，通过协同作用可有效降低马铃薯晚疫病的发病率。
Fengycin B通过诱导菌丝变形、氧化损伤和线粒体功能障碍抑制P.infestans菌丝体菌丝生长；surfactin通过加强植株防御基因（pod、pal和cat）表达，提高了POD、PAL和CAT的酶活，诱导马铃薯的植株防御反应以抵抗晚疫病的发生。但是，野生菌surfactin产量低（一般不到1 g/L），虽然通过基因工程改造和培养条件优化，目前已报道产量达到了16.7 g/L，但是仍存在生产成本高和产量低的问题，是工业化生产和实际应用的技术瓶颈。
Surfactin产生菌包括枯草芽胞杆菌（B.subtilis）、贝莱斯芽胞杆菌（B.velezensis）、解淀粉芽胞杆菌（B.amyloliquefaciens）、暹罗芽胞杆菌（B.siamensis）、地衣芽胞杆菌（B.licheniformis）和短小芽胞杆菌（B.pumillus）等多种芽胞杆菌。不同菌株产生的surfactin类型不同、脂肪酸碳链长度也不同，故生物活性也有所差异。鉴于芽胞杆菌产surfactin类型和功能的特异性，以及目前实际工业化生产和应用的技术瓶颈，从环境中分离筛选优良的产surfactin出发菌株，进而通过合成生物学技术和生产工艺优化，以及深入解析surfactin的生物活性机制具有重要的理论意义和潜在的巨大实际经济效益。
本研究利用选择性分离技术从植物根际筛选获得surfactin高产菌株C5A-1，通过分子生物学技术确定了该菌株的分类地位，通过全基因组测序分析和MALDI-TOF质谱鉴定所产surfactin的类型，并采用多种植物检测了该菌所产的surfactin的促生功能。研究结果丰富了脂肽产生菌资源，为通过合成生物学提高surfactin产量提供了优良的底盘细胞工厂，为深入研究surfactin生物合成调控机制和生防促生机制提供了理论基础。
Surfactin是芽胞杆菌属多个种类产生的次级代谢活性物质。我们通过选择性分离获得surfactin产生菌C5A-1，利用16S rRNA基因系统发育分析、全基因组平均核苷酸一致性分析和数字DNA-DNA杂交确定了C5A-1为芽胞杆菌属贝莱斯种的一株新菌株。目前surfactin的工业化生产和实际应用的技术瓶颈是产量低和成本高。从环境中分离的野生菌的surfactin产量一般低于1 g/L，如模式贝莱斯芽胞杆菌FZB42为505 mg/L，生防贝莱斯芽胞杆菌BBC047和BBC025分别为633 mg/L和405 mg/L。我们从杨树根际土中分离获得的C5A-1产surfactin高达1 208.16 mg/L，为通过代谢工程改善surfactin产量提供了优良的底盘菌株。Surfactin的结构一方面取决于7肽头部氨基酸类型，另一方面取决于脂肪酸类型和C链长度，脂肪酸链的长度为C12-C17不等。对surfactin理化性质的研究发现，在同系物C12-C15中，表面活性随着碳链长度的减小而降低（C12为32.2 mN/m），临界胶束浓度值（CMC）从C12的0.35 mmol/L下降到C15的0.08 mmol/L，胶束聚集数的范围从C12的4.7 nm升高到C15的5.7 nm。我们采用酸沉淀法制备C5A-1的发酵液粗提物，利用MALDI-TOF MS分析证实该菌主要产C14-和C15-surfactin A，为surfactin的功能研究和实际应用提供了结构基础。
结论
Surfactin肽段的合成是由次级代谢基因簇编码的非核糖体合成多肽（NRPS）完成的。NRPS是一种由重复模块组成的多模块巨型酶复合体，功能是将特定的氨基酸结合到肽骨架中。每个模块可以分解为以下3个主要的结构域：腺苷酸（A）结构域、巯基化（T）结构域（也称肽基载体蛋白，PCP）和缩合（C）结构域。A结构域负责识别、选择并激活特定氨基酸，并通过与ATP的反应催化特定氨基酸转化为氨基酰基腺苷酸；活化的氨基酸以硫酯的形式共价结合到T结构域的柔性辅基4′-磷酸泛酰巯基乙胺基臂上，形成氨酰基-S-载体复合物；C结构域负责催化新生肽和相邻模块携带的氨基酸之间形成肽键，并允许随后延伸链移位到下一个模块。部分模块内部还催化修饰氨基酸的差向异构化（E）结构域，肽链延伸循环结束后，末端硫酯酶（TE）结构域负责释放线性肽段，并催化肽段内部的环化。Surfactin的启动模块采用C-A-T结构，而非经典的A-T结构，该模块包含一个特殊的C-结构域，称为C-起始（Cs）结构域，负责已活化脂肪酸与第一个氨基酸残基连接，起始肽段的合成。我们利用Antismash分析C5A-1的次级代谢基因簇，预测发现surfactin的NRPS酶由srfA/lic操纵子，包含srfAA/licA、srfAB/licB、srfAC/licC和srfATE四个结构基因，预测会产生线性7肽（FA-L-Glu1-L-Leu2-D-Leu3-L-Val4-L-Asp5-D-Ley6-L-Leu7）；SrfAC的TE结构域会催化线性脂肽释放，并催化Leu7与β-羟基脂肪酸的羟基之间形成内酯键环化短肽。深入分析基因簇内容也包含了辅助surfactin合成基因、调控基因hxlR，以及转运相关基因等。我们对C5A-1的全基因组测序和次级代谢产物分析为基因工程改造法提高surfactin的产量提供了有利的遗传信息。
由于具有亲水的氨基酸头部和疏水的脂肪酸链尾巴这一特殊的结构特征，surfactin具有极强的表面活性和多样的生物活性，在化妆品、食品、医药、农林业及环境修复等领域具有巨大的应用潜力。不断增长的人口对粮食的需求不断增加，给农业和食品工业带来了额外的负担。化学农药、杀菌剂、化肥和高育种作物品种通常用于提高作物生产力，然而，化学品的过度开发及其在环境中的持续存在对土壤、水和空气产生了有害影响，从而扰乱了食物链和生态系统。农用化学品、农药、金属和碳氢化合物较低的水溶性和较高的疏水性使它们能够附着在土壤颗粒上，从而在环境中继续存在。化学农药，如有机磷、有机氯和氨基甲酸酯，经常用于保护农产品。通过surfactin或产生surfactin和降解农药的微生物，可以将黏附在土壤颗粒上的疏水污染物溶解或解吸。同时，surfactin对多种植物病原体具有广谱抗菌活性而被广泛研究。最新研究表明采用叶面喷施surfactin方式处理小白菜，可以显著提高其株高、根长以及叶绿素含量，初步揭示了surfactin作为植物生长刺激剂的潜在应用价值。我们利用盆栽实验检测了C5A-1发酵液surfactin提取物对毛白杨组培苗、玉米和大豆幼苗生长的调控功能，结果显示，不同浓度的surfactin对3种植物幼苗均具有显著的促生功能，该研究结果不但为C5A-1作为菌剂产品或其产物surfactin作为植物生长刺激剂应用于农林业提供了理论基础，同时为深入解析植物-微生物互作机制的解析提供新视角。