基于刃天青微量板法检测沙门氏菌抗生素的耐药性（二）
1.5刃天青工作条件的优化
用NB肉汤将沙门氏菌进行连续梯度稀释，分装96孔培养板中，每孔加入100μL，终浓度分别为7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，菌液浓度列间递减;同时每孔加入用NB肉汤稀释的不同浓度刃天青溶液100μL，终浓度为1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 mmol/L，刃天青浓度行间递减。设无刃天青含菌的NB肉汤为阳性对照，无菌含刃天青的NB肉汤为阴性对照，37℃恒温培养箱中培养12 h，每隔1 h观察颜色变化，检测荧光值，荧光激发波长为530 nm，发射波长为590 nm，并记录荧光数据。该试验测量荧光值和观察颜色变化来评价药物的抑菌效果，选用变为粉红色的时间为试验所需测试时间，并且将能明显显示细菌生长的刃天青浓度选为工作浓度。
1.6沙门氏菌生长动态观察
取培养的沙门氏菌，用NB肉汤稀释成不同浓度7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，分装于96孔板中，100μL/孔，再每孔加入100μL的工作浓度刃天青溶液，37℃恒温培养10 h，每隔1 h观察结果并同时检测荧光值。
1.7刃天青微量板药敏试验
将NB肉汤稀释的刃天青溶液100μL加到无菌的96孔培养板中，将抗生素加入第1孔，1～11孔进行梯度稀释，第12孔不加抗生素作为阳性生长对照。向每孔中加100μL培养的沙门氏菌菌悬液，在37℃恒温培养箱中孵育。选择对5种抗生素耐药或敏感的6株沙门氏菌进行药敏试验，根据颜色变化及荧光值来判断沙门氏菌是否生长及其对所试抗生素的敏感性。
1.8刃天青微量板的应用
将蛋洗净并浸泡在75%乙醇溶液中后，将蛋清和蛋黄在无菌条件下移入无菌均质袋中，并用均质器打浆2 min以制备悬浮液。通过将25 mL鸡蛋混合物添加到175 mL营养肉汤中来制备1∶10样品稀释液。用该稀释液将鼠伤寒沙门氏菌稀释成7.5×106 CFU/mL，然后按照“1.7”方法进行药敏试验。另取样品100μL，涂布NA琼脂平板，37℃培养24 h观察是否杂菌污染。
2结果与分析
2.1细菌浓度的确定
为了便于细菌定量检测，用细菌浊度仪测定沙门氏菌浊度，取定量稀释液涂布NA琼脂平板，培养24 h后进行菌落计数。经菌落计数，计算出0.5 MCF菌液对应的细菌培养物的菌落数为4.15×108 CFU/mL。
2.2刃天青工作条件优化
该试验测试沙门氏菌浓度与刃天青浓度的荧光值和颜色变化，根据其变化来优化测试条件。其中挑选3个时间点来进行结果说明。当培养3 h时，7.5×106 CFU/mL浓度细菌可使0.025～0.200 mmol/L刃天青变粉红色。当培养6 h时，细菌浓度≤103 CFU/mL，均不能使所用7种刃天青浓度变色，这显示沙门氏菌没有生长;当细菌浓度≥104 CFU/mL，0.025～0.400 mmol/L刃天青可以显示沙门氏菌生长，≥0.800 mmol/L刃天青的显色时间相对滞后，其中高浓度细菌（7.5×106 CFU/mL）在全浓度刃天青溶液中都变粉红色。培养12 h后，只有7.5×10 CFU/mL浓度的细菌在1.600 mmol/L刃天青浓度下不变色，其余浓度的细菌均可使刃天青变为粉色。荧光检测结果所得趋势同上。从7.5×105 CFU/mL细菌在不同刃天青浓度下随孵育时间的荧光检测结果（图1）可以看出，细菌与刃天青反应2 h后荧光差异明显，0.025～0.100 mmol/L刃天青在5 h内还原趋于饱和，0.200～0.800 mmol/L刃天青在5～6 h还原饱和;0.050～0.800 mmol/L刃天青的饱和荧光值接近，说明特定浓度细菌已被刃天青饱和或过饱和。试验结果表明，低浓度刃天青产生的荧光信号低，反应不灵敏，而过高浓度的刃天青会导致反应时间过长且荧光检测滞后。综合颜色变化和荧光值，在5个变色较快的浓度中，0.100 mmol/L刃天青的显色清晰，荧光值明显，因此选为刃天青微量板的工作浓度。
2.3沙门氏菌的生长动态
将不同浓度的沙门氏菌在刃天青微量板上培养12 h，每隔1 h观察结果。结果显示（表1），当细菌浓度为7.5×102、7.5×104和7.5×105 CFU/mL时，分别培养8、6和4 h即可见沙门氏菌生长;其中细菌浓度为7.5×10、7.5×103和7.5×106 CFU/mL时，分别在10、7和2 h显示为部分沙门氏菌生长。由此可见，刃天青微量板进行沙门氏菌药敏试验的判断时间可以控制在5 h。
2.4刃天青微量板药敏试验
用配制好的标准浓度抗生素进行沙门氏菌药敏试验，结果显示（表2），不同沙门氏菌分离株对抗生素氧氟沙星、氨苄西林、环丙沙星、美罗培南、四环素或敏感或耐药。依据CLSI的最新判断标准，刃天青微量板与微量肉汤稀释法药敏试验得到的耐药结果一致。这表明用刃天青微量板法可以在短时间内更为直观地观察到耐药结果。但在检测沙门氏菌对美罗培南耐药性时发现，因为所用沙门氏菌对美罗培南均为完全敏感，可以观察到在耐药折点有些菌株会有极轻微的变色。
在测量菌株耐药情况的同时，选择性地扩大抗生素的浓度范围，发现用刃天青微量板法得到的MIC值和微量肉汤稀释法的MIC值会有些许差异，沙门氏菌对环丙沙星和美罗培南的耐药性如表3所示。扩大浓度范围后，用2种方法测得的4株菌的MIC有差异。其中3株菌在测量对美罗培南耐药性时发现，用刃天青微量板法检测可以得到相对应的MIC值，但用微量肉汤稀释法检测得到的却为敏感，没有确切的MIC值。这可能是因为刃天青变色敏感，更易被人肉眼和荧光检测到，而微量肉汤稀释法只关注培养基的浑浊程度，无法精确得到耐药值。这间接表明刃天青微量板法比肉汤稀释法更灵敏，对研究菌株在低浓度抗生素中的生长情况有帮助，有益于在公共衛生方面的用药安全。
2.5刃天青微量板的应用
用氧氟沙星、氨苄西林、环丙沙星、美罗培南、四环素5种抗生素对实际样品进行刃天青微
量板快速药敏试验，并同时进行微量肉汤稀释法药敏试验对照，结果显示（表4），2种药敏试验方法的结果具有良好的一致性。
3结论
该研究以刃天青为检测物质，对食源性致病菌沙门氏菌的耐药性进行检测。所用刃天青微量板法得到的MIC与微量肉汤稀释法进行判断的结果具有良好的一致性，且更为灵敏、直观，在5 h内就可以得出药敏结果。其中肉眼观察在实际应用中较为方便，不受试验设备、场地的制约;荧光检测可以更清晰地明确耐药情况，获得整个耐药进程，且更为准确、客观和结果可量化。刃天青微量板法弥补了琼脂法等常规药敏试验方法无法动态检测细菌生长情况的缺陷，其优势在于其可清晰辨别耐药折点，动态地检测细菌的生长状况，在低浓度抗生素下可以得到更为精确的耐药值。刃天青微量板法具有简便、快速、灵敏、经济等优点，在检测各种细菌对抗生素的敏感性中有显而易见的优势。同时刃天青法为非特异性检测，在实际检测中有更好的应用价值。
相关新闻推荐
2、假交替单胞菌WCP15003的生长特性及其对哈维氏弧菌PBVH3311拮抗效果（三）