牦牛源短小芽孢杆菌生长曲线测定及药敏试验、体外抑菌结果解读（三）
2.4 TS1的药敏试验结果
由表3可知，短小芽胞杆菌TS1对β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢1/2/3/4代中常用的代表性药物中的复方新诺明、阿米卡星、氧氟沙星、氨苄西林、青霉素、庆大霉素、多西环素、环丙沙星、阿莫西林、美罗培南和头孢唑林极敏，对头孢他啶产生耐药，对头孢噻肟和头孢吡肟中度敏感，对头孢呋辛高度敏感。
表3短小芽胞杆菌TS1的药敏试验结果
2.5 TS1的体外抑菌试验结果
由图4可知:短小芽胞杆菌TS1对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌4种指示菌(革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌各2种)均产生较明显的抑菌作用，抑菌直径分别为18、21、28和23 mm，对革兰氏阳性菌的抑菌作用更明显，阴性对照组无抑菌圈(图4-A—D)，说明TS1产生了抑菌产物;全菌液和菌体对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌都产生了抑菌圈，上清液以及阴性对照组无抑菌圈(图4-E、F)，这可能与TS1的培养条件有关。
图4短小芽胞杆菌TS1体外抑菌试验结果
2.6 TS1的全基因组测序结果
由图5可知，TS1基因全长为3 646 887 bp，GC含量约为42.09%。BAGEL4中的结果显示其产生的抗菌肽与Amylocyclicin较为相近，且与数据库里的抗菌肽比对后发现相似度只有48.90%，说明TS1产生的抗菌肽可能是一种新型抗菌肽。
图5短小芽胞杆菌TS1全基因组测序及分析结果
3讨论与结论
畜禽养殖中细菌耐药性问题已日益严峻，对抗生素替代品的筛选和研究刻不容缓。益生菌添加剂不仅可以促进动物生长，还可抑制致病菌，同时通过调节畜禽肠道菌群维持肠道上皮稳态，从而促进畜禽肠道健康。目前市面上所售动物用益生菌产品大多数为枯草芽胞杆菌(Bacillus ubtilis)，少数为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)等。本试验从健康牦牛粪便中分离鉴定出了一株具有益生潜力的短小芽胞杆菌TS1。芽胞杆菌属在恶劣的环境中可以形成芽胞而存活，因此具有抗逆性好、易保存的优点。有研究表面，芽胞杆菌属因容易在畜禽肠道中定殖而发挥益生作用。
畜禽养殖中可以应用的益生菌应具备生长性能强、耐受恶劣环境的特点，因此筛选出具有耐受强酸性、高胆盐含量以及高温条件的菌株具有重要意义。本试验筛选的短小芽胞杆菌TS1在pH3左右时的存活率为31.4%，在牛胆盐浓度为0.3%时的存活率为65.4%，说明其具有较强的耐酸、耐胆盐能力。畜禽胃中大多为强酸环境，肠道中的胆盐含量为0.05%～0.3%，TS1具有较强的耐酸耐胆盐能力，足够数量的TS1可以通过胃肠，从而占据肠道生态位抑制致病菌的定殖，减少致病菌侵害。
TS1体外抑菌试验结果表明，TS1菌全菌液和离心后的菌体对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有一定的抑菌作用。有研究表明短小芽胞杆菌发挥抑菌作用可能是各种酶在发挥作用，也有研究认为是细菌素的作用。本研究通过全基因组测序结果推测TS1发挥抑菌作用的物质可能是抗菌肽Amylocyclicin，这是一种对革兰氏阳性菌有高抗菌活性的新型细菌素。Amylocyclicin是环状细菌素的一个成员，这是一类核糖体合成的多肽家族，它们因其热稳定性和高磷酸基团(PI)值而区别于其他细菌素并普遍存在于芽胞杆菌类群中。在许多革兰氏阳性细菌中都存在环状细菌素。本试验发现的Amylocyclicin与其他环状细菌素的同源性较低，如大肠杆菌的Carnocyclin(33.7%)、粪肠球菌的Enterocin(38.2%)、乳酸菌的Lactocyclicin(35.6%)。与同是芽胞杆菌FZB42的Amyloliquefaciens相比，同源性为48.9%，TS1 Amylocyclicin的核苷酸序列与芽胞杆菌属的序列相似性为97%～99%。有研究表明Amylocyclicin发挥抑菌作用的主要机制是破坏致病菌细胞壁使其形成孔洞，其内容物外泄，细菌因无法进行正常代谢而死亡。因此，本试验所分离的TS1具有潜在的替代抗生素的应用价值。Suda等研究表明芽胞杆菌产生抗菌肽的最适条件需采用BHI(brain heart infusion)培养基，于30℃有氧条件下振荡(150 r·min-1)培养。还有研究表明果糖和Landy培养基也会促进抗菌肽的产生和分泌。我们发现TS1序列中有编码抗菌肽Amylocyclicin的基因簇，但本实验未发现TS1的培养上清液具有明显的抗菌活性，推测该基因簇需要在一定的培养条件或者合适的培养基方可大量表达，对此尚需进一步优化培养条件进行深入探究。
本研究所筛选出的牦牛源短小芽胞杆菌TS1，具备生长速度快、稳定期时间长、抗逆性强、广谱抗菌的特点，基本具备了畜禽饲料添加剂临床使用的特性，具有开发成为畜禽用饲料添加剂的潜力。在此基础上，我们发现TS1的基因组中存在一段较新的编码抗菌肽的序列，其抑菌作用可能与此抗菌肽有关，但是具体的机制还需要进一步探究。
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