林氏扇头蜱抗菌肽重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线影响及抑菌效果（二）
1.2.2生物信息学分析
使用在线软件CAMPR3（http://www.camp3.bicnirrh.res.in/prediction.php）预测Microplusin-like基因的抑菌活性；用在线软件APD3（https://aps.unmc.edu/AP）对该基因的理化性质包括净电荷数、GRAVY总平均亲水性和Wimley-White全残基疏水性标度、蛋白结合势（Boman index）进行计算；使用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam）预测蛋白大小及等电点。
1.2.3重组质粒的构建、蛋白表达与纯化
在目的基因序列两端设计特异性引物，并添加保护碱基和XhoⅠ/XbaⅠ酶切位点，以1.2.1中测序正确的目的片段为模板进行PCR扩增，pCold-SUMO载体经XhoⅠ/XbaⅠ双酶切后，与目的基因连接并转化至DH5α感受态细胞，转化成功后提取质粒，命名为pCold-SUMO/Microplusin-like。将测序正确的质粒转化至Rosetta（DE3）感受态细胞，平板培养，挑取单克隆后的菌液培养至对数期，诱导表达后收集菌体，超声破碎，收集上清。利用Ni-NTA Resin对重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE检测蛋白表达纯化情况。以带His标签的鼠单抗作为一抗，HRP-山羊抗鼠作为二抗，对重组蛋白进行Western Blot检测。
1.2.4重组蛋白抑菌活性测定
1.2.4.1菌悬液的制备
将甘油保存的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门菌培养至对数生长期。采用浊度仪计算菌液浓度，并调节至1×106~1×107 CFU/mL菌悬液备用。
1.2.4.2纸片扩散法测定抗菌活性
采用滤纸片扩散法，在空白滤纸片上滴加30μL重组蛋白（浓度为10 mg/mL），用无菌镊子贴在含菌平板上，以SUMO空载蛋白及无菌水滤纸片作为阴性对照，以滴加20μL卡那霉素（浓度为50 mg/mL）滤纸片作为阳性对照，37℃恒温倒置培养16 h后，观察记录抑菌圈的有无，采用十字交叉法，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取平均值作为测定结果。结果判定参照《药理实验方法学》标准：抑菌圈直径<10 mm为抗药、10 mm为轻度敏感、11~15 mm为中度敏感、16~20 mm为高度敏感。
1.2.4.3最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）测定
参考美国临床试验室标准委员会推荐的方法，并稍作修改，测定重组蛋白的MIC和MBC。采用微量肉汤稀释法，在96孔板中进行试验。向A行和B行的第2~12孔各加入100μL MH液体培养基。在第1孔中加入100μL重组蛋白溶液，第2孔加入100μL重组蛋白后，逐孔进行对倍稀释，直至第12孔，弃去100μL。随后，向A行第1~12孔各加入100μL菌悬液，作为试验组。向B行第1~12孔各加入100μL MH液体培养基，作为阴性溶剂对照组。向C行各孔加入100μL MH液体培养基和100μL菌悬液，用于验证培养基是否支持菌株正常生长，作为阳性生长对照组。向D行各孔加入200μL MH液体培养基，用于检测培养基是否被污染，作为空白对照组。将96孔板置于37℃培养箱中孵育24 h，观察结果。阳性孔呈现浑浊，表明细菌正常生长；阴性孔和空白孔保持清亮，表明试验过程无污染。试验组中无肉眼可见菌体生长的最低药物浓度即为MIC。确定MIC后，取浓度≥MIC的菌悬液涂布于MH琼脂平板，37℃培养24 h，观察菌落生长情况，菌落数≤5时的最低药物浓度即为MBC。
1.2.4.4重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线、时间杀菌曲线的影响
选择大肠埃希菌ATCC25922作为指示菌，取菌悬液与重组蛋白混合，使其终浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC，不加重组蛋白的样品作为空白生长对照组，37℃孵育12 h，每小时使用酶标仪测量1次OD600 nm。以培养时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标绘制大肠埃希菌生长曲线。
取2 mL菌悬液至无菌试管，分别加入重组蛋白，使其终浓度为0 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC，置于37℃下孵育，分别于0、5、15、30、60、120 min取100μL菌悬液经适当稀释后涂布于MH琼脂平板，37℃孵育24 h后进行平板菌落计数。以培养时间为横坐标，菌落形成单位数的对数为纵坐标绘制大肠埃希菌时间-杀菌曲线。
1.2.5重组蛋白抗菌机制研究
1.2.5.1扫描电子显微镜分析
使用1 MBC浓度的重组蛋白处理大肠埃希菌为试验组，使用等体积PBS处理指示菌为空白对照组。37℃孵育1 h，将孵育后的菌液离心收集菌体细胞，PBS冲洗3次，向菌体沉淀中加入2.5%戊二醛，重悬菌体，4℃固定过夜，接着用乙醇脱水15 min，经临界点干燥仪充分干燥后，使用离子溅射仪喷金，通过扫描电镜对样品进行观察。
1.2.5.2透射电子显微镜分析
透射电镜的制样程序前期与扫描电镜相同，2.5%戊二醛溶液固定后，用1%锇酸固定液固定2 h，PBS洗涤3次后，使用丙酮对样品进行脱水，包埋切片后用醋酸铀-枸橼酸铅双染色，通过透射电镜对样品进行观察。
1.2.5.3林氏扇头蜱Microplusin-like蛋白三维结构预测与分子对接
利用AlphaFold工具构建多肽的三维结构模型，并通过在线平台SAVES（https://saves.mbi.ucla.edw）对模型进行质量评估，验证模型的准确性和可靠性，选择最优模型。选择E.coil外模脂多糖转运蛋白的X衍射晶体结构（PDB代码为4RHB），利用指示菌蛋白结构作为受体，AlphaFold工具构建的林氏扇头蜱Microplusin-like蛋白三维结构作为配体，使用Hdock进行分子对接。共采集100个对接构象；参照对接得分进行构象排序挑选出10个分数靠前的构象，根据结合位点选取最优构象。对接结果通过Pymol进行3D可视化分析，使用Ligplus软件进行2D可视化分析。
1.3统计学分析
所有试验平行3次，应用GraphPad 9.0统计学软件分析并绘图，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。