梅花鹿源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定、测序、毒素型、生化、耐药性分析（二）
1.5.3 PCR毒素分型鉴定取纯化后的菌液作为模板，反应体系为模板2μL，上、下游引物各1μL,2x Green Taq Mix 10μL,ddH2O补足20μL,每对引物单独体系。参照Nguyen等的引20μL,每对引物单独体系。参照Nguyen等的引物序列对分离株毒素进行鉴定,引物信息见表1。反应条件:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸10 min。产气荚膜梭菌分型系统为A型(cpa+)、B型(cpa+,cpb+,etx+)、C型(cpa+,cpb+,cpe+/-)、D型(cpa+,etx+,cpe+/-)、E型(cpa+,itx+,cpe+/-)、F型(cpa+、cpe+)、G型(cpa+、NetB+)。
1.6生化鉴定
严格按照微量生化反应管使用说明和判定原则对分离株进行生化反应鉴定，分别进行了蔗糖、鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、木糖、棉子糖、乳糖、阿拉伯糖、明胶、硝酸盐、硫化氢、尿素共13种生化鉴定反应，反应结果与《伯杰氏鉴定细菌学手册》第八版中产气荚膜梭菌菌株生化特征进行比对。
1.7药敏试验
根据临床和实验室标准研究所(CLSI)推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法测定分离菌对21种常用抗菌药物的敏感性。挑TSC上单菌落接种于RCM培养基,石蜡液封,42℃培养,当OD{}_{600~nm}=0.6~0.8时,吸取300μL菌液均匀地平铺于Muel-ler-Hinton琼脂,随后将21种抗生素药敏纸片放置于培养基上,42℃厌氧培养24h。利用游标卡尺测量抑菌圈直径,并参照CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验执行标准》和制造商的说明书对分离菌的耐药情况进行判定。
1.8半数致死量检测及病理观察
48只小鼠随机分为6组，每组8只，雌雄分笼，1~5组为试验组(D1~D5组),6组为健康对照组(H组)。通过预试验检测LD。和LD100。将LD
作为第1组攻毒剂量,LD100作为最后1组攻毒剂量,各组剂量按等比排列,公比r=√LD100/LD0(G为组数)将小鼠随机分成G组，每组8只小鼠。试验组每只小鼠腹腔注射菌液0.2mL,对照组每只小鼠腹腔注射0.2mL无菌生理盐水。注射后密切观察小鼠3d内死亡情况并做好试验记录，症状明显的小鼠采样心、肝、脾、肺、肾、小肠等组织制作病理组织切片并观察。使用SPSS19.0软件录入数据，按照“分析”→“回归”→“概率P”→“确定”的步骤分析计算，当P=0.5时所对应的值即为菌株的LD50及95%置信区间。
绘制标准回归曲线为y=0.0064x+0.221 9,R2=0.9784具有强相关性(P<0.001)。肾脏和肠内容物样本OD{}_{450~nm}分别为0.624、1.003,带入回归曲线计算可得肝脏和肠内容物中a毒素含量分别为62.86、122.12 ng·mL{}^{-1}。
2结果
2.1 a毒素鉴定
以标准品浓度作横坐标,对应 OD值作纵坐标,绘制标准回归曲线为y=0.0064x+0.2219,R2=0.9784具有强相关性(P<0.001)。肾脏和肠内容物样本 OD450nm 分别为 0.624、1.003,带入回归曲线计算可得肝脏和肠内容物中 α毒素含量分别为62.86、122.12ng·mL-1。
2.2 细菌分离鉴定及毒素分型
2.2.1 细菌分离鉴定分离菌株在RCM液体培养基中生长时出现浑浊并产生气泡;在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂(TSC)培养基上形成直径2~5mm的外围含有一圈白色晕圈的圆形黑色菌落(图1A);在7%羊血琼脂培养基上可形成表面光滑、颜色灰白、透明状的圆形菌落(图1B);镜检为革兰阳性短杆菌(图1C)。
2.2.2 16S rRNA检测16S rRNA基因PCR扩增产物大小约为1500bp(图2),与预期长度一以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，
A.TSC培养基;B.7%羊血琼脂培养基;C.镜检结果(10x100)
图1分离株的培养特性及染色镜检
致。将测序结果在NCBI进行相似性比对，结果显示分离株与产气荚膜梭菌参考菌株相似率均在99%以上，确定该分离株为产气荚膜梭菌，且与新疆上传的产气荚膜梭菌序列(PP627254.1)处于同一分支(图3)，亲缘关系较近。
2.2.3 PCR毒素分型鉴定
如图4所示，多重PCR结果显示分离株仅在cpa基因处出现目的条带，条带大小符合预期的324bp，未扩增出其余毒素分型基因，该菌株为A型产气荚膜梭菌。
2.3生化试验鉴定
分离株能发酵蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖，液化明胶,硝酸盐还原试验、硫化氢试验阳性;不能发酵鼠李糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、棉子糖，尿素试验阴性,符合《伯杰氏鉴定细菌学手册》中产气荚膜梭菌生化特性。
2.2.2 16S rRNA检测16S rRNA基因PCR扩增产物大小约为1500bp(图2),与预期长度一样。
M.DNA相对分子质量标准;1.分离株样本;N.空白对照
图2 16S rRNA基因PCR扩增电泳图
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