青贮饲料中耐高温乳酸菌的生物学特性及发酵特性研究（二）
1.2 227株乳酸菌基因组的提取
将227株乳酸菌置于37℃中过夜培养，10 000 r·min–1离心5 min，用TE缓冲液在15 mL离心管中洗涤两次后再离心。DNA提取采用TIANamp细菌DNA试剂盒(DP302-02，天根科技有限公司，北京，中国)。DNA使用前保存在–20℃。
1.3 227株乳酸菌16S rRNA基因序列鉴定
对227株乳酸菌16S rRNA序列进行PCR扩增。1μL DNA作为模板，PCR引物为27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′)，反应体系为20μL体系。PCR程序：95℃下处理5 min；94℃变性30 s，在55℃下退火1 min，循环30次；72℃延伸15 min，最后72℃保温10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳在1×TBE缓冲液中检测PCR产物质量，合格的PCR产物送上海生工公司进行序列分析。利用BLAST分析方法，将测得的16S rDNA序列与GenBank的16S rRNA序列进行比对，相似度高于99%的序列被认为是同一株菌。
1.4乳酸菌的筛选及生理生化特性测定
分离到的227株乳酸菌首先放置于MRS液体培养基中37℃培养，在12和24 h时测其OD600 nm及pH，筛选出生长效率最高、产酸能力最强的30株菌。再将初筛出的30株菌放置于MRS培养基中45℃培养，在12和24 h测其OD及pH，筛选出生长效率最高、产酸能力最强的4株乳酸菌(LP149、LS358、LR753和LPA761)乳酸菌鉴定方法，对这4株菌进行革兰氏染色、菌落形态、过氧化氢酶活性和葡萄糖产气试验。糖发酵试验采用试剂盒方法(陆桥科技有限公司，北京，中国)。
1.5筛选到的4株乳酸菌系统发育树的构建
利用BLAST分析方法，将16S rDNA序列与GenBank的16S rRNA序列进行比对，通过邻接法构建系统发育树。使用CLUSTALW软件对1 000个随机重采样的序列数据进行bootstrap分析，评估系统发育树的拓扑结构。以枯草芽孢杆菌NCDO1769为外围菌株。本研究中4株乳酸菌16S rRNA基因序列已被GenBank收录，序列号：MH337263为LP149，MH333261为LS358，MH333262为LR753，MH333263为LPA761。
1.6筛选到的4株乳酸菌耐温、耐酸及耐盐测定
耐温试验：将筛出的4株菌(LP，ATCC 14917；LS，ATCC 11741；LR，ATCC 7469；LPA，ATCC 334)、标准菌及商业乳酸菌(LPC，四川高福记生物科技公司)接入MRS液体培养基中，分别置于4、10、20、30、40、45、50℃培养箱中，培养3 d后测定各组发酵液的OD600 nm，每个处理重复3次。
耐酸试验：用经过无菌处理的HCl溶液和NaOH溶液调整MRS液体培养基pH，将上述菌株接入pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37和45℃的培养箱中培养3 d，测定培养基OD600 nm。
耐盐试验：将上述活化的乳酸菌接入NaCl溶液体积分数为3.0%和6.5%的MRS液体培养基中，分为两组，分别在37和45℃的培养箱中培养3 d，于600 nm处测定培养基OD值。OD值<0.05代表不生长(–)，OD值在0.05～0.1表示微弱生长(W)，OD值在0.1～0.5表示生长(+)，OD值>0.5代表生长良好(++)。
1.7筛选到的4株乳酸菌在不同温度条件下生长曲线测定
将活化好的菌和所对应的标准菌株(LP，ATCC 14917；LS，ATCC 11741；LR，ATCC 7469；LPA，ATCC 334)及一株商业植物乳杆菌(LPC，四川高福记生物科技公司)接种到MRS液体培养基中，每组设置3个重复，分别置于37与45℃培养箱中恒温培养。每隔2 h取一次液体发酵液样品，连续测定48 h，以空白的MRS培养基为对照，在600 nm下测定样品的OD值，以培养时间为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标，绘制乳酸菌生长曲线。
1.8筛选到的4株乳酸菌在不同温度条件下的产酸曲线
将活化好的上述乳酸菌接种入MRS液体培养基中，培养方法同上，每组设置3个重复，分别置于37和45℃培养箱中恒温培养，每隔2 h采用pH计测定各菌株发酵液pH，连续测定48 h，以空白的MRS培养基为对照，以培养时间为横坐标，pH为纵坐标，绘制乳酸菌产酸速率曲线。
1.9数据分析
采用SPSS统计软件包的单因素方差分析法(ANOVA)，对生长曲线和产酸曲线进行分析。采用Turkey显著性差异(HSD)检验对不同的样本均值进行检验，P<0.05为显著。
2.结果
2.1西南湿热地区自然乳酸菌群落结构
通过16S rRNA测序和序列分析比较(表1)，227株乳酸菌菌株分属乳酸杆菌属、片球菌属(Pediococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)(图1)，其中包含了8个种的乳酸菌：植物乳杆菌(L.plantarum)142株，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)30株，副干酪乳杆菌(L.paracasei)21株，分别占乳酸菌总数的62.55%，13.21%，9.25%；戊糖片球菌(P.pentosaceus)10株，占4.40%；乳酸菌片球菌(P.acidilactici)8株，占3.52%；L.farraginis 9株，占3.96%；食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)3株，占1.32%；唾液乳杆菌(L.salivarius)和W.paramesenteroides各2株，均占0.88%。
图1西南高温高湿地区玉米和狼尾草青贮前后乳酸菌种群结构
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