草鱼性腺细胞系生长曲线测定及对鲤春病毒血症病毒敏感性研究（三）
2.1.3细胞核型
对100个分裂中期的细胞进行染色体数目统计分析。结果显示，在GCO细胞系染色体中，2n=48的分裂相占(98%)(图4)，二倍体染色体数目出现频率非常高，其他非整数倍体只占了很小的比例。
图4 GCO染色体核型
2.2 GCO细胞系对SVCV的敏感性
2.2.1病毒生长曲线
SVCV接种GCO细胞出现典型CPE(图5)后，检测SVCV的滴度，并绘制病毒的生长曲线(图6)。
图5 SVCV-10/3在GCO中的CPE
图6 SVCV-10/3在GCO中的生长曲线
2.2.2 GCO和其他几种常用鱼类细胞系对SVCV易感性的比较
SVCV分别接种GCO、EPC、FHM和CHSE-214。出现CPE后，根据殷震等(1997)的方法测定TCID50(表1)。从表1可以看出，SVCV在GCO和EPC的滴度明显高于FHM和CHSE-214。
表1不同细胞感染SVCV毒株的病变和病毒滴度
2.2.3 SVCV诱导不同细胞凋亡
通过流式细胞仪检测SVCV诱导的GCO、EPC、FHM和CHSE-214。发现SVCV引起GCO的凋亡率为38.0%，EPC为30.7%，FHM为17.5%，CHSE-214为13.3%(图7)。
图7流式细胞仪检测SVCV诱导不同细胞凋亡
2.2.4电镜观察SVCV感染GCO细胞系
将SVCV接种GCO细胞后，电镜观察可见，在GCO细胞质内有典型弹状病毒颗粒(约为140 nm，图8)。
图8 GCO感染SVCV后电镜照片
3讨论
本研究通过对GCO细胞生长曲线绘制和形态学观察等发现，GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃，最适生长温度为25℃。一种细胞系的生长温度在一个宽泛的范围，使该细胞系具备了可以分离淡水鱼病毒和冷水鱼病毒的潜力(Nicholson et al，1987)。GCO细胞系的这一特点使得它未来可以广泛地用于水生动物病毒的分离。通过对GCO细胞系细胞周期、染色体核型的分析发现，GCO细胞系呈典型的二倍体特征，染色体数为2n=48，这与舒琥等(2014)和Beck等(1984)描述的草鱼的染色体特征相符，说明GCO细胞系保持着稳定而正常的草鱼生理学特征，未发生变异，是可靠的病毒分离与检测的工具。
目前，SVCV病毒已经在世界范围内广泛存在，可以感染鲤鱼(肖克宇等，2004)、鲫鱼(Carassius auratus)(Rougée et al，2007)等多种鲤科鱼类，造成鱼类多器官感染。SVCV存在多种分离株，如欧洲株、亚洲株等。世界动物卫生组织(OIE)推荐使用EPC分离SVCV病毒，但就目前的现状，EPC不足以全面地对进出口鲤科鱼类SVCV感染情况进行监测，这就需要寻找更多的SVCV敏感细胞。
本研究通过接种SVCV病毒，检测细胞凋亡、CPE观察、病毒粒子观察，发现SVCV能够很好地在GCO细胞内增殖，出现明显的病变。与其他已知的SVCV易感细胞相比，GCO细胞对SVCV更加易感，可以快速出现CPE，病毒滴度更高。研究结果显示，GCO细胞可以作为分离SVCV病毒的可靠实验工具。
研究表明，GCO对多种水生动物病毒有敏感性。张奇亚等(2012)用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV，也称为草鱼出血病病毒Grass carp hemorrhage virus，GCHV)感染GCO细胞，通过电镜在GCO细胞内观察到病毒粒子，诱导GCO细胞形成含多个细胞核的合胞体，细胞变大并发生崩解。这一现象说明，GCO细胞可以用来分离GCHV病毒，但敏感性不如草鱼肾脏细胞(CIK)(肖雪，2007)1)。江育林等(1999)用GCO细胞从甲鱼(Amyda sinensis)中分离到甲鱼虹彩病毒(STIV)，孙颖杰等(2009)用GCO细胞从石鲽鱼(Platichthys bicoloratus)中分离到牙鲆(Paralichthys olivaceus)弹状病毒。GCO细胞具有生长活力强、细胞纯度高、细胞形态典型以及对病毒的特异性高等优点，是一个具有广阔应用前景的生物模型。
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