环链棒束孢2018BY-1菌株生长曲线测定方法——引言、材料与方法
摘要：明确环链棒束孢的生长曲线，为环链棒束孢代谢物的采集、孢子规模化生产奠定基础。采用重量法、显微直接计数法、比浊法3种方法对环链棒束孢2018BY-1菌株的生长规律进行研究。结果表明，环链棒束孢的生长规律为0~3 d为迟缓期，3~5 d为对数期，5~6 d为稳定期，6 d以后为衰亡期；最大吸收波长为410 nm，此时菌丝干重、OD410值、孢子数均达到最大值，分别是0.22±0.00 g、0.64±0.03、4.14×10^8个/mL；对数期的OD值和孢子数存在线性关系；稀释培养基的浓度可以降低培养基中色素对菌液的影响。
引言
环链棒束孢（Isaria cateniannulata）又名环链拟青霉（Paecilomyces cateniannulatus）、环链虫草（Cordyceps cateniannulata），属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，虫草属，是20世纪80年代初，梁宗琦从茶卷叶蛾蛹茧和一种鞘翅目昆虫上分离到的新种。其主要分布于园林生态中，数量仅次于球孢白僵菌，是一类广谱性的生防真菌，可直接用于农林害虫的防治，尤其对鳞翅目、半翅目、鞘翅目、蜱螨目和膜翅目等节肢动物害虫防治效果较好；其代谢产物具有重要的药用和经济价值，如内酯类化合物、苯乙醇、2，6-二叔丁基-4-（（二甲氨基）甲基）苯酚、角鲨烯等被广泛用于医药、食品和化妆品领域，然而其孢子、代谢产物的最佳采集时间至今还未见报道。
为弄清环链棒束孢的生长发育规律，找到其迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期4个时期的时间节点，本研究采用重量法、显微直接计数法、比浊法3种方法，通过测量其生长量、孢子数目、吸光度等来绘制环链棒束孢2018BY-1菌株的生长曲线，以期为代谢物的采集、孢子规模化生产奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
环链棒束孢2018BY-1菌株，分离自黑唇平背叶蜂幼虫，采集地为贵阳市云岩区百宜镇荞麦田间，目前保藏于贵州师范大学荞麦产业技术研究中心。
1.1.2培养基
PDA液体培养基：葡萄糖20 g/L，去皮马铃薯200 g/L，1000 mL蒸馏水。将去皮马铃薯切块煮沸30 min，用4层纱布过滤后，再加入葡萄糖，溶化后加蒸馏水补足1000 mL，121℃灭菌25 min。
1.2试验方法
1.2.1种子液的培养
将环链棒束孢2018BY-1菌株接种到装有100 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中，于25℃，150 r/min的恒温摇床中培养5 d，使其浓度达到1×10^8个/mL，用于后续实验。
1.2.2最大吸收峰的确定
取1.2.1中的菌液3 mL，利用紫外可见分光光度计在波长290~530 nm内进行测量。3个生物学重复，3个技术学重复，筛选出最大吸收峰。根据王敏等的方法进行，改进了波长测定范围。
1.2.3培养液中色素的影响
在环链棒束孢2018BY-1菌株培养过程中，分别取0~10 d的不接种不离心的培养液、高速离心后的上清液、高速离心后的上清液稀释10倍的3种液体，在410 nm下测其吸光度。3个生物学重复，3个技术学重复。根据王敏等的方法进行，改进了培养时间。
1.2.4比浊法、显微直接计数法、重量法测定生长曲线
准备装有100 mL PDA液体培养基的250 mL锥形瓶33个，于超净工作台中各加入1.2.1中培养的种子液3 mL，将0 h锥形瓶取出3个放入4℃冰箱中保存，其余30个置于25℃，150 r/min的摇床中培养，每隔24 h取出一个锥形瓶收集培养液，直至第10 d，用分光光度计测定其OD值，3个生物学重复，3个技术学重复，对照组为PDA液体培养基。用血球计数板（25格×16格）测定孢子数量，3个生物学重复，根据李勤的方法进行。
准确量取10 mL培养的环链棒束孢2018BY-1菌液，在15000 r/min的离心机下离心30 min，倒去上清液，加无菌水，再一次离心分离，倒去上清液，置于30℃干燥箱中烘干后称重，自然冷却后用电子天平称其质量，3个生物学重复。根据王敏等的方法进行，改进了离心时间、转速、烘干温度。
1.3数据分析
孢子数（个/mL）=（X1+X2+X3+X4+X5）/5×400×10^4×菌液稀释倍数。X1、X2、X3、X4、X5表示血球计数板的5个中格，采用五点取样法计数。
用Excel 2010进行基础数据统计分析和作图，SPSS 24.0软件进行统计分析。