无质粒微生物平台可用于在常温下实现闭环PET回收和可持续升级循环（一）
1.摘要
在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）酶解液中，对苯二甲酸（TPA）可通过基于酸析的方法高效回收，留下富含乙二醇（EG）的无TPA的PET水解液，作为适用于微生物生物转化的非粮碳源。本研究通过质粒介导的、在启动子gyrA（PgyrA）控制下串联过表达醇氧化还原酶（FucO）和醛脱氢酶（AldA），对大肠杆菌MG1655(DE3)进行工程化改造，使其能够同化EG进行生长，在72小时内达到了最高细胞密度（OD600为2.59）和42.3%的EG消耗。随后，利用CRISPR相关转座酶系统将该EG同化盒整合至染色体，首次构建了无质粒的EG营养型大肠杆菌菌株MGEG27，其在72小时内消耗了79%的EG。继而应用适应性实验室进化（ALE）以增强大肠杆菌MGEG27的EG同化能力，获得了大肠杆菌ALE1-7，其在48小时内OD600达到5.45，EG消耗率达到98.7%。最后，对大肠杆菌ALE1-7进行改造，使其表达PET水解酶BHR4M、TFU6M和FastPETase，从而能够同时降解PET并基于EG生长。在一个闭环PET降解系统中，大肠杆菌生长与PET水解同时进行，分别产生了1.12 mg/L、0.79 mg/L和0.32 mg/L的TPA。本研究提出了一种无质粒的微生物平台，用于在常温下实现闭环PET回收和可持续升级循环。
2.背景
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）作为饮料和食品包装常用材料，其广泛使用加剧了塑料污染。当前物理、化学回收方法因高能耗，在经济性和环保性上存在局限，而生物降解法在温和条件下展现出可持续优势。基于对苯二甲酸（TPA）低溶解度和高结晶度的特性，可通过酸沉淀法从PET水解液中高效回收，剩余富含乙二醇（EG）的水解液成分类似M9基本培养基，是理想的微生物底物。
EG作为低成本双碳化合物，是极具价值的生物技术碳源，还能替代葡萄糖等粮食基碳源，避免与粮食供应竞争，且已有二氧化碳电化学还原、木质纤维素水解等可持续生产方式。多种微生物可通过需氧或厌氧途径同化EG，但大肠杆菌虽含相关同化基因（fucO和aldA），其天然表达受严格调控，无法高效利用 EG。现有工程大肠杆菌虽能以 EG 为碳源合成高值化学品，却面临有毒中间体积累、碳源旁路损耗及质粒表达系统不稳定等问题。
本研究以大肠杆菌 MG1655 (DE3) 为宿主，通过质粒过表达关键同化基因评估其EG利用潜力，借助CRISPR相关转座酶系统将EG同化模块整合至基因组，构建无质粒菌株，再经适应性实验室进化强化EG同化能力，最终设计出闭环系统：工程菌既能利用PET水解产生的EG生长，又能表达PET水解酶降解塑料，为常温PET废物升级循环提供了可扩展方案，助力塑料循环经济发展。
3.结果
3.1 野生型大肠杆菌在EG及其代谢产物上的生长与毒性
先前的研究已证实，野生型大肠杆菌无法利用乙二醇（EG）作为唯一碳源进行生长。为阐明这一限制机制，评估了大肠杆菌在EG及其两个关键代谢中间体（GA和GLA）上的生长情况，这些中间体位于拟议EG同化途径中乙醛酸（GLX）的上游（图1a）。生长曲线分析表明，在以乙醇酸钠（GA-Na）为唯一碳源的M9基本培养基中，菌株生长显著，OD600在48小时内达到峰值3.6（图1b）。然而，当EG或GLA作为唯一碳源时，菌体几乎不进行生长，表明EG氧化的初始步骤存在代谢瓶颈。
毒性测试显示，EG在高达720 mM浓度下仍无显著生长抑制（图1c），生物相容性良好。相反，GLA表现出剂量依赖性毒性：6 mM延长滞后期，8 mM则完全抑制生长（图1d）。GA同样显示浓度依赖性抑制，50 mM时完全抑制生长（图1e），这可能与其引起培养基酸化（pH从7.11降至5.06）导致的酸应激有关。
约氏红球菌、恶臭假单胞菌等微生物可通过醇氧化还原酶（FucO）和醛脱氢酶（AldA）途径将EG转化为GLA，再转化为GA，从而高效同化EG。因此，在大肠杆菌中过表达fucO和aldA基因，有望解除GLA积累毒性，并重建完整的EG分解代谢通路。
图1. 大肠杆菌MG1655(DE3)中EG同化作用及其中间产物细胞毒性的表征。
3.2 通过选择启动子促进携带质粒的大肠杆菌在EG中的增强生长
为实现在有氧条件下将乙二醇（EG）转化为乙醇醛（GLA），本研究采用了耐氧的醇氧化还原酶突变体fucO(I6L/L7V)。通过构建由组成型启动子PgyrA驱动的fucO与aldA基因共表达，获得了工程菌株MGEG02。该菌株在90 mM EG的M9培养基中培养72小时后，OD600达到2.59，EG消耗率为42.3%（图2），证实了该代谢途径对EG同化的有效性。
为优化通路效率，进一步比较了五种不同强度的组成型启动子（PM93、PT7、PJ23107、PJ23109、PJ23119）驱动的表达效果。如图2所示，各工程菌株的生长与EG消耗表现差异显著（图2a）。其中，由最强启动子PJ23119驱动的菌株MGEG14的OD600为1.83，EG消耗率为30.2%（图2b）。而由启动子PM93和PJ23109驱动的菌株则几乎无法生长，表明过强的表达可能造成代谢负担或干扰。启动子PT7和PJ23107驱动的菌株表现中等，但均未超越原始PgyrA驱动的菌株MGEG02。综上，启动子PgyrA在EG同化途径中展现出最佳的适配性与平衡性。与需要添加诱导剂的诱导型系统相比，使用此类组成型启动子能简化发酵过程，更有利于基于EG的规模化生物制造。
图2. 通过组成型启动子优化fucO-aldA共表达可提升大肠杆菌对EG的同化能力。