酪酸梭状芽孢杆菌生长与活菌计数：高层半固体琼脂试管法VS固体琼脂平板法（一）
摘要：
验证了高层半固体琼脂试管法比固体琼脂平板法更具有良好的厌氧性能，能准确地对酪酸梭状芽孢杆菌进行活菌计数。通过对发酵培养基中不同碳源、氮源、生长因子进行单因素研究，L9(34)正交实验进一步优化得到最佳培养基组成为(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖8，酵母膏4。用此培养基在37℃培养24h，活菌数可达4.1×108 mL-1。培养基中添加K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L培养32 h时，酪酸梭状芽孢杆菌芽孢转化率可达95%。
酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)，又名丁酸梭状芽孢杆菌和宫人菌。人们研究酪酸梭状芽孢杆菌有130多年的历史，现在被越来越多地研制成饲料添加剂和兽药等。酪酸梭状芽孢杆菌在肠道产淀粉酶、蛋白酶、维生素K和氨基酸等多种酶类和营养物质，这些活性酶对动物的营养物质的吸收和利用有促进作用，并且可以提高动物的生产性能。酪酸梭状芽孢杆菌专性厌氧，有着促进有益菌和抑制有害菌的双重作用，并纠正肠道菌群失调，减少肠道疾病的产生，起到动物防病的作用。因其良好的特性，从而克服了使用抗生素作为普通饲料添加剂带来的副作用。酪酸梭状芽孢杆菌内生芽孢，作为饲料添加剂，避免了在其他益生菌制作和贮存等过程中易受外界各种物化因素影响而失去活性等的问题，具有广阔的发展前景，表现出巨大的社会效益和生态效益。为此，本文以提高酪酸梭状芽孢杆菌菌体得率和芽孢转化率为指标，对活菌计数法进行了选择改进和对发酵培养基各组分进行优化，降低成本，获得有效且简易的发酵培养基，为进一步实现工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)菌株，天津科技大学微生物菌种保藏管理中心保藏。
1.2 培养基
种子培养基：脑心浸液37 g/L。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20，牛肉浸膏10，酵母膏6，葡萄糖4，K2HPO4 2，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.4，CaCl2 0.2，FeSO4 0.1，盐酸半胱氨酸0.5，pH 7.2。
高层半固体琼脂培养基：液体发酵培养基添加0.3%的琼脂。
固体平板计数培养基：液体发酵培养基加2%的琼脂。
1.3 培养方法
种子培养：液体试管深层静置培养，37℃厌氧培养16 h。
发酵培养：5%的接种量加入发酵培养基于100 mL平底烧瓶中，37℃厌氧培养32 h。
1.4 检测方法
1.4.1 活菌数量的测定
高层半固体琼脂试管计数法，用移液管取1 mL菌液加到9 mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅匀，不要有气泡，依次进行10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，每个稀释度作3个平行，37℃厌氧培养36 h。
固体琼脂平板计数法：取1 mL发酵液加入到9 mL灭菌的生理盐水中，依次进行10倍梯度稀释，选取3个适当的稀释倍数，吸取1 mL稀释液注入无菌培养皿中，倾法加入15 mL培养基混匀，每个稀释度作3个平行。37℃厌氧培养48 h。
1.4.2 芽孢数量的测定
取菌液5 mL于80℃水浴加热10 min，杀死营养体细胞，然后进行适当10倍梯度稀释，其后操作同活菌计数法。
1.5 数据处理
用SPSS软件分析所得结果，各组数据均以平均数±标准差(x±s)表示。进行方差分析和t检验。
2 结果与讨论
2.1 不同活菌计数法对实验结果的影响
酪酸梭状芽孢杆菌是严格厌氧细菌，在有氧气的环境下会停止生长。用固体平板培养计数必须具备严格的厌氧条件，才能确保所测得的数据准确可靠。因此，创造无氧的环境来进行活菌计数是必要的。根据高层半固体琼脂培养基较好的厌氧性能，且稀释管和计数管于同一管，降低了氧对菌体的毒害，因此用高层半固体试管法与固体平板法进行了比较。高层半固体试管法培养36 h和固体平板法培养48 h后计生长菌落数，并换算出发酵液中的活菌数，结果见表1。
表1 不同活菌计数法实验结果(n=3)
| 组号 | 活菌数/(108 mL-1) | |
|---|---|---|
| 固体平板培养 | 高层半固体试管培养 | |
| 1 | 1.11±0.60a | 4.10±0.13b |
| 2 | 1.45±0.48a | 3.93±0.16b |
| 3 | 1.53±0.41a | 4.05±0.15b |
注：a、b不同字母之间的差异P=0.05。
由表1可知，固体琼脂平板法计数法与高层半固体琼脂试管法有显著差异(P<0.05)。固体琼脂平板法计数活菌时，每组实验均值较低(最大可达1.53×108 mL-1)，且标准差值较大。高层半固体琼脂试管法与之相比，平均值较高(最大可达4.10×108 mL-1)，且每组标准差值较小，能够较准确地反映酪酸梭状芽孢杆菌的活菌数。所以，本文采用高层半固体琼脂试管法来测酪酸梭状芽孢杆菌活菌数，既简便快速，又节约了成本和减少菌体在氧气中暴露的时间。
2.2 碳源对活菌数量的影响
以原培养基为基础，分别添加10 g/L的葡萄糖、蔗糖和玉米粉等作为碳源，考察不同碳源对酪酸梭状芽孢杆菌活菌数的影响，结果如图1所示。
碳源对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
图1 碳源对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
由图1可见，以葡萄糖为碳源时，对菌体生长影响最为明显，最大活菌数可达3.1×108 mL-1，远远高于其他碳源，所以选择葡萄糖作为碳源。
2.3 氮源对活菌数量的影响
根据2.2的结果，继续分别添加20 g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏以及玉米浆作为氮源，考察氮源对活菌数的影响，结果见图2。
氮源对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
图2 氮源对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
由图2可知，添加胰蛋白胨时，24 h活菌数较高，可达3.5×108 mL-1；而添加蛋白胨以及大豆蛋白胨这些氮源时，活菌数较低；玉米浆虽是速效氮源，但不利于菌体生长，活菌数最低，仅为1×108 mL-1，所以选择胰蛋白胨作为氮源。目前研究酪酸梭状芽孢杆菌用的氮源基本是复合氮源，如胰蛋白胨、酵母膏和牛肉膏这3种氮源的复合，相应菌体活菌数可达5.5×108 mL-1。本研究进行培养基优化，选择胰蛋白胨作为氮源，减少了复合氮源的成分，降低培养基的成本，活菌数可达3.5×108 mL-1。
2.4 生长因子对活菌数量的影响
在上述确定的条件基础上，以葡萄糖为碳源，胰蛋白胨为氮源，分别选取0.3%酵母膏、牛肉膏、玉米浆、牛心浸汁和牛脑浸汁进行酪酸梭状芽孢杆菌生长因子的选择实验，结果见图3。
生长因子对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
图3 生长因子对酪酸梭状芽孢杆菌生长的影响
由图3可以看出，5种生长因子的效果基本接近，其中，牛心浸汁和牛脑浸汁对菌体生长效果较好，活菌数为3.8×108 mL-1，但这两种成本较高。而添加酵母膏时，活菌数为3.6×108 mL-1。酵母膏中富含丰富的氨基酸、维生素等活性因子，有利于菌体生长，而且可以补充菌体发酵中后期的氮源，综合经济成本和发酵考虑，选用酵母膏作为生长因子。
相关新闻推荐
1、林氏扇头蜱抗菌肽重组蛋白对大肠埃希菌生长曲线影响及抑菌效果（三）