末水条斑紫菜通过促进丁酸产生菌与杯状细胞增殖改善小鼠肠道健康
2.5末水条斑紫菜对小鼠肠道菌群物种组成的影响
如图5-A所示:3组小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、髌骨菌门(Patescibacteria)、弯曲菌门(Campilobacterota)、放线菌门(Actinobacteriota)、脱铁杆菌门(Deferribacterota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)等组成。肠道菌群中,厚壁菌门与拟杆菌门的占比约98%。厚壁菌门主要协助宿主有效吸收膳食中的能量,其众多成员均属于有益菌的范畴,对宿主健康具有积极的促进作用;拟杆菌门则参与代谢多糖、类固醇及维持肠道正常生理等功能。由表3可见:对照组中厚壁菌门占比52.9%,拟杆菌门占比39.46%,低剂量组中厚壁菌门与拟杆菌门的占比分别为67.56%、27.41%,高剂量组中厚壁菌门与拟杆菌门的占比分别为74.41%、21.07%。与对照组相比,高剂量组中小鼠肠道菌群厚壁菌门与放线菌门占比显著增加,拟杆菌门显著减少。低剂量组小鼠肠道菌群厚壁菌门增加,拟杆菌门减少。此外,高剂量组小鼠肠道菌群中放线菌门较对照组显著增加。综上所述,高剂量末水条斑紫的摄入能够导致肠道菌群结构改变。
图5-B为各组小鼠肠道菌群在属水平的组成。各组小鼠菌群主要由杜氏杆菌属(Dubosiella)、norank_ f_Muribaculaceae、Norank_ f_norank_o_Clostridia_UCG-014、乳酸菌属(Lactobacillus)、Lachnospiraceae_NK4A136_ group、Prevotellaceae_UCG-001、Candidatus_Sacchrimonas、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、另枝菌属(Alistipes)、拟杆菌属(Bacteroides)等组成。由表3可见:与对照组相比,低剂量组与高剂量组杜氏杆菌属占比均显著增加,杜氏杆菌属是特定肠道菌群,其代谢产物为丁酸。高剂量组中另枝菌属占比与对照组相比显著减少,瘤胃球菌属显著增加。其中,另枝菌属隶属于拟杆菌门,该菌属在肠道内的丰度变化可能产生双重影响,既可能对机体健康产生积极效应,亦可能引发不良后果。瘤胃球菌属是降解抗性淀粉的关键菌,该菌能够稳定肠道屏障、逆转腹泻、降低结直肠癌风险。低剂量组中Mucispirillum属占比显著增加。Mucispirillum是一种在宿主健康状况下的标志性菌属,它的丰度变化经常与肠道炎症的进展有关。当病原菌属攻击或损伤肠黏膜时,Mucispirillum的丰度会减少,而在病原体被清除后,Mucispirillum的丰度也会逐渐恢复到健康状态。因此,Mucispirillum可以作为远端结肠表层黏膜层健康水平的标志。Norank_ f_norank_o_Clostridia_UCG-014、螺杆菌(Helicobacter)等致病菌占比减少,而双歧杆菌属占比增加。
2.6短链脂肪酸含量与肠道菌群组成关联分析
图6显示了小鼠粪便细菌在属水平的丰度与6种短链脂肪酸含量之间的Spearman相关系数的层次性聚类,通过计算获得相关性r值和P值,r值在图中以不同颜色展示。相关分析表明,乙酸含量与瘤胃球菌属(Ruminococcus)呈显著正相关(r<0.75,P<0.05),而瘤胃球菌属在高剂量组小鼠肠道中显著增加,末水条斑紫菜能够通过增加瘤胃球菌属的丰度来促进乙酸合成;杜氏杆菌属(Dubosiella)与异丁酸(r<0.72)和正丁酸(r<0.95)呈显著(P<0.05)、极显著(P<0.001)正相关,杜氏杆菌属占比在低剂量组与高剂量组中显著增加,因此摄入末水条斑紫菜导致小鼠结肠中丁酸含量的增加可能与其促进杜氏杆菌属的生长有关;丁酸与另枝菌属(r<-0.87,P<0.01)、Lachnospiraceae_NK4A136_group(r<-0.80,P<0.01)、Candidatus_saccharimonas(r<-0.68,P<0.05)均呈显著负相关,其中,另枝菌属的占比呈显著下降趋势,这一变化与丁酸含量的增加相吻合,进一步验证了之前的试验结果,Lachnospiraceae_NK4A136_group与Candidatus_saccharimonas占比减少,但差异不显著。
3讨论与结论
本研究系统考察了末水条斑紫菜对健康C57BL/6J小鼠肠道组织结构及肠道菌群构成的影响。通过每日对小鼠进行1次末水条斑紫菜的灌胃处理,发现小鼠的体重与进食量均未出现显著变化,这表明末水条斑紫菜对小鼠的生长性能并无显著性影响。
试验进行28 d后对小鼠解剖取样,摄入末水条斑紫菜组的小鼠结肠组织切片更为完整、杯状细胞增多;而摄入低剂量末水条斑紫菜组的小鼠结肠长度显著增长,高剂量组则无显著变化。杯状细胞在肠道上皮细胞中主要通过分泌黏液蛋白,在上皮层面形成黏液层,从而隔离并控制肠道微生物的定殖和入侵,这在肠道免疫过程中起着关键作用。Gālin,a等研究表明,饲料的营养水平可能会影响肠道上皮杯状细胞数量、分泌功能以及肠道屏障。Chen等发现小麦麸和豌豆纤维使断奶仔猪结肠上皮细胞数量显著增多。因此,小鼠结肠中杯状细胞增多可能是末水条斑紫菜中膳食纤维的作用。本研究还发现高膳食纤维饮食能够增加结肠的长度,这可能与增大吸收面积的适应性措施有关。而紫菜中富含膳食纤维,其中大多数成分可抵抗胃和小肠的消化与吸收。但是,Kawabata等发现过量的膳食纤维饮食会导致肠梗阻。因此,我们猜测结肠长度的变化可能与紫菜中不可被胃与小肠消化的膳食纤维在结肠中缓慢消化有关,但是过量的膳食纤维会减弱该作用。因此,1.15 g·kg-1的摄入量具有增益效果。
通过测定结肠内容物中SCFA含量,灌胃低剂量与高剂量的末水条斑紫菜组小鼠丁酸含量均显著增加,并且无量效关系。SCFA不仅是肠上皮细胞重要的能量来源,还能够调节宿主免疫反应。而丁酸盐是结肠细胞增殖和维持肠道屏障的主要能量来源。研究发现,丁酸与人体健康密切相关,在大脑神经保护、调节肠道菌群、抑制炎症、癌症等疾病方面具有重要作用。丁酸在肠道内主要由膳食纤维酵解产生。肠道内以膳食纤维为底物的产丁酸菌将其分解为单糖后,经过关键酶和一系列代谢途径最终合成丁酸。因此,我们推测末水条斑紫菜促进了肠道内产丁酸菌的生长繁殖。还有研究表明肠道中的丁酸可以通过促进肠道巨噬细胞M2极化,经WNT-ERK1/2轴,恢复肠上皮杯状细胞数量和功能,从而促进肠道黏液屏障的修复。这可能是本研究结肠组织病理切片中杯状细胞数量增加的原因。
肠道菌群作为生物体最大的共生生态系统,参与调节肠黏膜屏障的完整性和功能性。Chao1指数表示估算样品中所含OTU数目的指数,数值越大表示样本中所含物种越多。Shannon指数为评估样本中各物种组成的丰富度和均匀度,数值越大表示该环境的物种越丰富,各物种分布的均匀度越高。Simpson指数则是从一个样本数据中随机抽取2个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),它们分别属于不同物种的概率,这一概率越大代表样本的物种丰富度越低。本研究通过16S rDNA高通量测序结肠内容物中的菌群结构,发现灌胃末水条斑紫菜的2组小鼠肠道微生物多样性均降低,并且无量效关系。这可能与灌胃末水条斑紫菜后饮食营养结构发生改变,营养成分丰富度降低有关。在属水平,灌胃末水条斑紫菜的小鼠肠道菌群中产丁酸的杜氏杆菌属占比显著增加,Norank_ f_norank_o_Clostridia_UCG-014、Helicobacter等致病菌占比减少。这与Yi等研究结果相似:樟芝增加了急性酒精肝损伤小鼠肠道有益菌的丰度,减少了致病菌的占比。有研究发现杜氏杆菌能够提高肥胖小鼠体内有益微生物的丰度,并且改善由高脂饮食引发的菌群结构紊乱。还有研究也验证了杜氏杆菌属在减少氧化应激、重塑肠道菌群方面的能力。因此,末水条斑紫菜可以调节肠道微生物组成,增加有益菌占比,减少致病菌占比,从而使有益菌在肠道微生物中占主导地位,这可能也解释了Alpha多样性丰富度下降的原因。Spearman关联分析显示,丁酸的含量与杜氏杆菌属的占比呈显著正相关。因此,摄入末水条斑紫菜后,小鼠结肠中丁酸含量的上升与末水条斑紫菜对杜氏杆菌属生长的促进作用密切相关。
综上,本研究结果表明低剂量与高剂量的末水条斑紫菜均能够调节健康C57BL/6J小鼠肠道菌群结构,并且影响SCFA的含量,其中与丁酸含量呈显著正相关的杜氏杆菌占比显著增加。综合结肠组织长度的变化,末水条斑紫菜1.15 g·kg-1的摄入量对小鼠机体增益效果最佳。该研究结果可为末水条斑紫菜的高质化研发利用提供理论基础。
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