应用oCelloScope在线监测协同多指标分析揭示光轮层炭壳菌的液体发酵规律
光轮层炭壳菌菌丝体液体发酵过程中若干生长指标的动态变化研究
摘要
目的：采用液体培养，研究发酵过程中光轮层炭壳菌（Daldinia eschscholzii）菌丝体生长指标的动态变化情况。方法：采用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（oCelloScope）实时、无标记监测菌丝生物量动力学；并分别采用考马斯亮蓝G-250法、紫外吸收法、氮蓝四唑（NBT）光化还原法、福林酚法，测定菌丝体蛋白质含量、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及多酚含量。结果：在一定的发酵时间内，发酵液的pH无明显变化；基于oCelloScope的实时生长曲线显示，菌丝体生物量在第10天达到最大，干重对应为700 mg/100 mL；蛋白质含量最大可达到85.7 mg/g；CAT和SOD最高活性分别为44.11 U/g和68.74 U/g；多酚含量最大可达到2.65 mg/g。结论：明确了光轮层炭壳菌菌丝体几种重要生理生化指标的动态变化规律，结合高分辨率的生长动力学数据，进一步揭示了其生长代谢特征，为其菌丝体的深度开发利用提供了重要依据。
光轮层炭壳菌(Daldinia eschscholtzii)隶属于子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，粪壳菌纲Sordariomycetes，炭角菌亚纲Xylariomycetidae，炭角菌目Xylariales，炭角菌科Xylariaceae，轮层炭壳属(Daldinia)，是药用真菌，可治惊风[1]。采用分子生物学手段进行分析，获得该菌的ITS序列号JN182921。Kamila等[2]对D. eschscholtzii形态学特征进行过描述，并对其菌丝体生长条件进行了探索。轮层炭壳属的大多数种能引起寄主植物生理白腐，是重要的木材腐朽菌[3]，也是昆虫共生菌，这在菌物界有着重要的意义。同时，该属菌种在药物开发领域可能有着巨大的开发潜力和利用价值。Stadler等[4]发现D.concentric存在三萜类化合物。Zhang等[5]对D.eschscholtzii进行深入分析，发现这种菌的4类新骨架及6个新化合物，其中部分化合物具有很好的免疫抑制活性，这一结果对研制新型免疫抑制剂具有重要意义。Fang等[6]揭示了其几种炭壳菌聚酮的特殊结构来源，以及构效机理，这将有助于促进免疫抑制聚酮化合物的人工合成。
本试验对光轮层炭壳菌菌丝体发酵期间的菌丝产量、发酵液pH、菌丝体蛋白质含量、多酚含量、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶的活性进行了动态研究，得出其发酵期间的生长规律，了解其菌丝生长的生理变化情况。这对调节及控制其生长有着重要的指导意义，也对后续研究和开发利用提供了重要依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1 供试菌株：光轮层炭壳菌从野外采集，菌种保藏在西南科技大学生命科学与工程学院微生物实验室。
1.1.2 仪器：超净工作台，恒温培养箱，全温振荡培养箱，恒温鼓风干燥箱，精密酸度计，Eppendorf离心机，SPECORD 200 PLUS紫外可见分光光度计，Thermo多功能酶标仪，丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（oCelloScope）。
1.2培养基
斜面培养基：1000mL中含去皮马铃薯200g的汁液，葡萄糖20g，蛋白胨2g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，琼脂20g，pH自然[7]。
种子培养基：斜面培养基去琼脂。
液体培养基：斜面培养基去琼脂。
1.3方法
1.3.1 培养方法
菌种活化：将保存的菌种接种到斜面培养基上，放入25℃恒温培养箱，长满待用。
种子液制备：取活化菌种1cm²左右，接入装有150mL种子液培养基的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温振荡培养。
菌丝培养：装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中接入种子液，接种量为1%，28℃、100r/min恒温振荡培养。
1.3.2 菌丝量动态测定
使用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（oCelloScope） 进行实时、无标记监测。取适量种子液，接种至含有液体培养基的透明平底微孔板中，置于oCelloScope系统内，于28℃下静态培养。系统自动按设定时间间隔（如每小时）对每个孔进行全视野扫描成像，并通过图像分析软件实时计算并记录菌丝体的生物量（基于图像对比度与面积），绘制连续的生长曲线。为验证数据，在关键时间点同步进行传统干重测定：取样，过滤收集菌丝，经蒸馏水洗涤3次，60℃烘至恒重后称量。菌丝量以每100mL发酵液中收集的菌丝干重表示(mg/100mL)。
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