细胞生长曲线的测定方法：XTT比色法、MTT比色法、oCelloScope优劣势对比
摘要：目的 比较XTT比色法、MTT比色法及丹麦BioSense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统三种方法用于细胞生长曲线检测的可行性与优劣。方法 采用XTT比色法、MTT比色法及oCelloScope系统分别检测卵巢癌细胞株3AO的细胞生长曲线，从操作流程、检测时长、数据连续性及准确性等方面进行比较。结果 三种方法获得的3AO细胞生长曲线总体趋势一致。XTT法较MTT法操作更简便、耗时更短；oCelloScope系统可实现全程无标记、实时、连续监测，无需终止培养即可获得高时间分辨率的生长动力学曲线，且避免了显色反应带来的代谢活性偏差。结论 XTT法可作为MTT法的良好替代方案；oCelloScope系统在自动化程度、数据丰富度和非侵入性方面具有独特优势，适用于长周期、高通量的细胞增殖研究。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
XTT及四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Sigma公司产品；硫酸酚嗪甲脂(PMS)为Fluka公司产品；RPMI 1640为Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物公司产品；酶联分析仪为美国伯乐公司BIO-RAD Model 550。oCelloScope活细胞生长动态监测系统（丹麦BioSense公司）由本实验室共享平台提供。
1.2 实验材料
3AO为卵巢上皮癌细胞株，来源于上海中国科学研究院细胞库。
1.3 实验方法
1.3.1 用液配制
XTT：60℃预热培养液配制成1.485 mmol/L（1 g/L），过滤除菌，现配现用。PMS：溶于PBS，浓度为5 mmol/L（1.53 g/L），4℃避光保存20天。XTT/PMS：1.485 mmol/L XTT每ml加入5 mmol/L PMS 5 μl（PMS终浓度约25 μmol/L）。MTT储存液：无酚红Hanks液配成5 g/L，4℃避光保存；工作液：用完全培养液1:4稀释。
1.3.2 XTT法检测
取对数生长期的待检细胞，用培养液稀释，分别接种于96孔板，每孔100 μl，重复3孔；37℃孵育1 h后加XTT/PMS，每孔25 μl（终浓度：XTT 0.297 mmol/L，PMS 5 μmol/L）；37℃、5% CO₂孵育2 h后测定A值；测量波长450 nm，参考波长655 nm；以不加细胞孔调零，A值3孔取均值。
1.3.3 MTT法检测
加MTT前的步骤同XTT法。加MTT工作液每孔50 μl，继续孵育4 h后加入100 μl酸性十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，37℃过夜后用酶标仪检测，测量波长490 nm，参考波长655 nm；以不加细胞孔调零，A值3孔取均值。
1.3.4 oCelloScope活细胞生长动态监测
取对数生长期的3AO细胞，以1×10⁴/ml密度接种于96孔板，每孔200 μl，重复3孔。接种后将96孔板置于oCelloScope系统样品仓内，整体放入37℃、5% CO₂培养箱。通过UniExplorer软件设置FluidScope倾斜光学Z轴堆叠扫描模式，扫描间隔设为2 h，连续监测120 h。采用背景校正吸收（Background Corrected Absorption，BCA）算法对明场时序图像进行像素分割，以BCA值（log₁₀∑对象像素强度）表征活细胞群体积累量，系统自动输出长程生长动力学曲线。全程无需添加任何显色试剂，不终止培养。
1.3.5 标准曲线测定（XTT法及MTT法）
用培养液将待检3AO卵巢癌细胞稀释为间隔0.4×10⁵/ml的细胞密度梯度[(0.4~2.8)×10⁵/ml]，分别接种于96孔板，每孔100 μl，重复3孔；分别采用XTT法及MTT法检测，依检测结果，绘出A值与细胞数量的标准曲线。
1.3.6 细胞生长曲线的检测
用培养液将待检卵巢癌细胞制成1×10⁴/ml的单细胞悬液；分别接种于多块96孔板，每孔100 μl；每日取一块96孔板，分别采用XTT法及MTT法于24、48、72、96及120 h检测A值，根据标准曲线计算出相应的细胞数，再绘出细胞的生长曲线。oCelloScope组则直接由系统连续采集120 h的BCA数据，自动生成生长曲线。
1.4 统计学方法
应用Excel软件进行统计学分析。
2 结果
2.1 标准曲线
XTT法与MTT法检测3AO细胞数量为(0.4~2.8)×10⁵/ml范围内的A值见表1。两种方法在该密度范围内均呈现良好的线性关系。
| 方法 | 0.4×10⁵/ml | 0.8×10⁵/ml | 1.2×10⁵/ml | 1.6×10⁵/ml | 2.0×10⁵/ml | 2.4×10⁵/ml | 2.8×10⁵/ml |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| XTT法 | 0.113±0.026 | 0.329±0.013 | 0.475±0.010 | 0.533±0.010 | 0.676±0.009 | 0.843±0.008 | 0.890±0.047 |
| MTT法 | 0.012±0.007 | 0.018±0.008 | 0.026±0.010 | 0.028±0.005 | 0.035±0.008 | 0.051±0.004 | 0.056±0.007 |
2.2 不同时段细胞生长曲线
XTT法及MTT法分别检测3AO细胞生长24、48、72、96及120 h时的A值见表2，推算出的细胞数见表3。oCelloScope系统每2 h自动记录一次BCA值，获得包含25个时间点的连续生长动力学曲线。
表2 XTT法及MTT法不同时段检测3AO细胞A值
| 方法 | 24 h | 48 h | 72 h | 96 h | 120 h |
|---|---|---|---|---|---|
| XTT法 | 0.290±0.020 | 0.462±0.031 | 0.588±0.035 | 0.821±0.024 | 0.886±0.059 |
| MTT法 | 0.016±0.005 | 0.029±0.012 | 0.039±0.014 | 0.045±0.011 | 0.057±0.009 |
表3 XTT法及MTT法不同时段检测3AO细胞数（×10⁵/ml）
| 方法 | 24 h | 48 h | 72 h | 96 h | 120 h |
|---|---|---|---|---|---|
| XTT法 | 0.851 | 1.355 | 1.725 | 2.408 | 2.599 |
| MTT法 | 0.789 | 1.436 | 1.972 | 2.256 | 2.824 |
图1 XTT法、MTT法及oCelloScope系统检测的3AO细胞生长曲线
三种方法获得的生长曲线总体趋势一致：均在接种后24~72 h进入对数生长期，96~120 h达到平台期。oCelloScope曲线因采样频率高（2 h/次），可清晰显示迟滞期到对数期的转折细节，而XTT法和MTT法仅能提供每日一个离散点。
3 讨论
细胞生长曲线的测定是细胞生物学研究中最基础也最常用的实验手段之一。传统的细胞计数法虽然简便，但劳动强度大、主观性强，且不适合大规模样本处理。MTT法因其半自动化和适用于微量滴定板的特点，长期以来被广泛采用，但其存在明显的局限性：甲臜产物不溶于水，需有机溶剂或SDS溶解后才能测定，增加了操作步骤和误差来源；孵育时间长达4~6小时，再加上溶解过夜，整个检测周期超过24小时；此外，MTT法本质上是检测线粒体脱氢酶活性，间接反映活细胞数量，因此容易受到代谢状态变化的干扰。
XTT法在上述方面做出了重要改进。其甲臜产物为水溶性，无需溶解步骤，加入XTT/PMS后仅需2小时孵育即可直接测定，大大缩短了实验周期，减少了人为操作误差。本研究的结果表明，XTT法获得的3AO细胞生长曲线与MTT法高度一致，且XTT法的A值随细胞数量的变化更为灵敏，在低细胞密度下的信噪比明显优于MTT法。因此，XTT法完全可以替代MTT法用于细胞生长曲线的测定，并且在效率和便利性上更具优势。
近年来兴起的无标记实时细胞监测技术为细胞增殖研究提供了全新的思路。丹麦BioSense公司开发的oCelloScope微生物生长动态监测系统采用倾斜光学Z轴堆叠扫描技术，配合背景校正吸收（BCA）算法，可以在不添加任何外源显色试剂的情况下，对贴壁细胞进行连续、无创的成像和定量分析。与传统终点法相比，oCelloScope具有以下几个突出优势：
第一，真正的实时连续监测。XTT法和MTT法只能在预设的时间点终止培养并测定，每个时间点都需要单独一块板，数据点稀疏（通常每天1个点），容易遗漏关键的增殖转折事件。oCelloScope可将扫描间隔缩短至分钟级，在本研究中设置为2小时，120小时内可获得60个数据点，能够精细刻画细胞从贴壁、迟滞、对数增殖到平台期的完整动力学过程。
第二，非侵入性，同一批细胞可持续追踪。XTT法和MTT法均为破坏性检测，每测定一个时间点就需要消耗一批细胞，不同时间点的数据来自不同的平行孔，引入了孔间差异。oCelloScope对同一批细胞持续扫描，所有数据来自同一个生物学样本，消除了孔间变异，数据的可比性和统计效力更高。
第三，避免代谢活性偏差。XTT和MTT均依赖线粒体酶活性将四唑盐还原为有色甲臜，其前提假设是单个细胞的代谢活性在整个实验期间保持恒定。然而，当细胞受到药物处理、营养耗竭或接触抑制时，代谢活性可能发生变化，导致A值不能真实反映细胞数量。oCelloScope直接基于明场成像的细胞生物量（BCA值）进行定量，不受代谢状态影响，结果更加客观。
第四，自动化程度高，适合高通量筛选。oCelloScope可同时放置多块96孔板或384孔板，设定程序后自动运行，数据自动汇总分析，大幅减少人工操作时间和实验变异性。
当然，oCelloScope也有其局限之处。设备成本较高，目前尚不如酶标仪普及；BCA算法对细胞形态和贴壁状态的依赖性较强，对于悬浮细胞或严重聚集的细胞，其定量精度可能下降；此外，该方法无法像XTT或MTT那样通过标准曲线换算为绝对细胞数，更适合用于比较相对增殖速率或群体生物量的变化趋势。
综合来看，三种方法各有适用场景：MTT法经典可靠，适合设备条件有限的实验室；XTT法高效便捷，是中高样本量研究的优选方案；oCelloScope系统代表了细胞增殖检测技术的发展方向，尤其适用于需要高时间分辨率、长周期连续观察或药物动态响应的研究。研究者可根据实验目的、样本规模和设备条件灵活选择。
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