图1、采用“进化与重测序”实验设计，以模拟单核细胞增多性李斯特菌对苯扎氯铵的耐受性。首先，对三种系统发育上不同的李斯特菌菌株（ALE_10-WT、ALE_16-WT和ALE_20-WT）在完整基因组组装和注释的基础上测定其苯扎氯铵最低抑菌浓度（MIC）。随后，每种菌株的三份样本分别在含有低于MIC的亚致死浓度苯扎氯铵（1 μg/mL低于MIC）的培养基中连续传代约70天。接着，重新评估了经苯扎氯铵诱导的菌株的MIC。对每种苯扎氯铵诱导的谱系进行基因组测序，以识别导致苯扎氯铵耐受性增强的突变，并对部分谱系的转录组进行分析，将其与在苯扎氯铵胁迫期间的祖先进行比较。

图2、苯扎氯铵在苯扎氯铵进化菌株中的最低抑菌浓度。通过在含有200 μL TSB并添加不同浓度苯扎氯铵的96孔微孔板中培养24小时，测定OD600值，确定苯扎氯铵在液体培养基中的最低抑菌浓度（MIC）。当OD600 < 0.1时，细菌生长的最低苯扎氯铵浓度即被确定为MIC。此外，还使用固体TSA培养基，在不同浓度（4–6 μg/mL）苯扎氯铵的条件下培养24小时，测定苯扎氯铵的MIC。随后利用Interscience Scan 1200对菌落进行定量分析，未出现菌落的最低苯扎氯铵浓度即被视为MIC。实验分别在野生型和苯扎氯铵进化菌株（A和B）ALE_10-苯扎氯铵、（C和D）ALE_16-苯扎氯铵以及（E和F）ALE_20-苯扎氯铵中进行了液体和固体培养基的检测。

图3、在无苯扎氯铵压力和有苯扎氯铵压力条件下，祖先株与苯扎氯铵进化株的单核细胞增多性李斯特菌（L. monocytogenes）生长动力学。过夜培养物经调整至OD600为1.0后，用无菌PBS稀释10倍，最终获得约10⁴ CFU/mL的接种量；取该接种液5 μL，以三重复方式分别加入含有不同苯扎氯铵浓度（0至6 μg/mL）培养基的96孔板中。在室温下使用oCelloScope测量48小时内的生长动力学，并以背景校正吸收度（BCA）表示。每个图示展示了三代复制样本中祖先株（WT，实线蓝色）和苯扎氯铵进化株（EVO，虚线红色）的平均BCA值，阴影带表示±1个标准差。图A–C分别显示了在不同苯扎氯铵浓度（0、2、3、4、5、6 μg/mL）下的ALE_10、ALE_16和ALE_20的生长情况

图4、抑制外排泵对祖先型和BAC进化型单核细胞增多性李斯特菌（L. monocytogenes）菌株中BAC及商用消毒剂耐受性的效应。测定祖传型（WT）与BAC进化型ALE_10（蓝色）、ALE_16（洋红色）和ALE_20（黄色）菌株对（A）苯扎氯铵（BAC，μg/mL）和（B）Virex II 256一步式消毒清洁剂（ppm）的最低抑菌浓度（MIC）。通过在含有200 μL TSB+YE培养基的96孔微孔板中，以不同浓度的消毒剂进行24小时生长后，采用琼脂平板微量稀释法测定MIC；当某浓度下可抑制可见生长（OD600 < 0.1）时，该浓度即定义为MIC。为评估活性外排对消毒剂耐受性的影响，实验在添加肾上腺素（20 μg/mL）。一种已知的外排泵抑制剂（图示条形柱）的条件下重复进行。Virex II 256的活性成分包括8.704%二癸基二甲基氯化铵和8.190% n-烷基二甲基苄基氯化铵。在肾上腺素存在下MIC降低表明，耐受性依赖于外排泵的抑制作用。

图5、显示了BAC进化支系相对于其各自亲本菌株的基因表达差异。图中（A）ALE_10.3-bac、（B）ALE_16.3-bac、（C）ALE_20.1-bac和（D）ALE_20.3-bac的火山图。垂直虚线表示表达差异阈值，依据对数倍增变化（log2(FC)）大于1（上调）和小于−1（下调）来定义。水平虚线表示使用Bonferroni校正P值确定的显著性阈值。

总结

单核细胞增生李斯特菌在食品加工环境中持续定植的防控工作，长期受限于该菌对苯扎氯铵（BAC）等季铵盐类消毒剂耐受性的挑战。为阐明BAC耐受及抗生素交叉耐药的遗传与分子演化路径，本研究对3株系统发育背景不同的单核细胞增生李斯特菌（每株设3个独立进化谱系）开展亚致死浓度BAC下的进化-重测序实验，连续传代约400~500代。

结果显示，全部9个BAC暴露谱系对BAC的最小抑菌浓度（MIC）均显著升高，部分谱系对商用消毒剂的耐受性也同步增强；值得注意的是，多个谱系对氟喹诺酮类药物表现出交叉耐药。对进化终点谱系的全基因组测序分析发现，fepR转录调控因子存在反复、平行的突变（多为无义突变），其相邻外排泵基因fepA同时出现错义突变，提示多重耐药与毒性化合物外排（MATE）家族外排活性去抑制是BAC及氟喹诺酮耐受的核心机制。BAC胁迫下的转录组（RNA-seq）分析显示，所有进化谱系中磷酸转移酶系统（PTS）基因均一致上调；与之呼应，我们在编码HPr磷酸载体蛋白的ptsH基因中观察到趋同错义突变，部分突变位点位于HPr丝氨酸磷酸化区域。

生物物理建模预测这些HPr突变体具有显著的构象去稳定化效应，与BAC胁迫下PTS信号通路紊乱的表型相符。外排抑制剂利血平可显著降低fepR/fepA突变背景菌株的BAC耐受性，但对携带bcrABC（质粒编码的BAC耐药外排盒）的菌株作用极弱，凸显了耐受机制的菌株依赖性。

综上，本研究揭示了外排驱动及PTS关联的BAC适应机制，为食品加工环境中抗生素交叉耐药的产生与病原菌持留提供了机制层面的解释，对优化消毒防控策略具有重要参考意义。本研究揭示了"外排驱动（fepR/fepA）"与"PTS信号关联（ptsH）"两条互补的BAC适应路线，将消毒剂适应与抗生素耐药联系起来，为食品加工环境中李斯特菌持久性防控、耐药监测及消毒策略优化提供了机制层面的理论依据。本研究采用丹麦Biosense Solutions公司研发的oCelloScope活菌成像系统完成李斯特菌生长动力学的高分辨率动态监测，oCelloScope具备的无损、高通量、高时间分辨率检测特性，弥补了传统终点OD检测无法捕捉生长动态过程的局限，为BAC耐受表型的精准量化、演化适合度效应的客观评估提供了可靠的数据基础，直接支撑了研究中关于耐受演化无系统性适合度代价的结论推导。

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