香芹酚对恶臭假单胞菌生长、运动能力、产胞外蛋白酶和生物被膜能力影响（二）
1.3.2泳动性和群集性测定
培养基配制好后，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。摇匀后，各接种3μL样品溶液至泳动性和群集性平板中央。将平板于30℃恒温培养箱中培养24 h后，测量菌株蔓延分散距离。
1.3.3嗜铁素产生情况测定
按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。培养基凝固后，每孔加入100μL稀释的恶臭假单胞菌样液。将平板于30℃恒温培养箱中培养24 h后，测量嗜铁素平板中黄色晕圈的直径。
1.3.4胞外蛋白酶的测定
LB营养琼脂灭菌冷却至约50℃后，将LB营养琼脂与单独灭菌的脱脂奶粉混匀，使脱脂奶粉的最终质量分数为1.0%，倒平板，并用牛津杯打孔，备用。将恶臭假单胞菌过夜培养活化，并调节OD600 nm约为1.00，按1∶1 000的比例加入到LB肉汤中，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。摇匀后，分别向打孔平板中加入100μL样液，将平板置于30℃培养箱培养24 h后，使用游标卡尺测量3组脱脂奶粉琼脂平板中透明圈的直径。
1.3.5生物被膜形成能力的测定
将恶臭假单胞菌过夜活化至OD600 nm约为1.00，用LB肉汤以1∶100的比例稀释，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数香芹酚的菌悬液，同时做空白对照和DMSO对照。取200μL上述菌液于96孔板中，将96孔板置于30℃培养箱下静置培养24 h，吸去孔中的菌液，残留生物被膜用200μL去离子水洗涤3次。向每个生物被膜孔添加200μL 0.1 g/100 mL结晶紫溶液，28℃染色20 min。染色后的生物被膜用200μL去离子水冲洗3次，吸干，最后加入等体积95%乙醇洗脱5 min后，使用酶标仪测定OD600 nm，以此表征恶臭假单胞菌的生物被膜形成能力。
1.3.6核酸泄漏量的测定
将恶臭假单胞菌接种至肉汤培养基，于28℃水浴振荡器中活化24 h，吸取菌悬液于4℃、8 000 r/min离心5 min后收集沉淀，并用磷酸盐缓冲溶液洗涤、重悬并调整菌悬液至OD600 nm约为1.00，按1.3.1节方法配制含有不同体积分数73香芹酚的菌悬液并设置空白对照和DMSO对照。将样品置于28℃水浴振荡器中振荡培养活化，分别于15、30、45、60 min取菌悬液，4℃、8 000 r/min离心5 min，使用移液器吸取上清液，并用紫外-可见分光光度计测定OD260 nm。
1.3数据处理
每组实验做3次以上平行重复，采用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据分析，采用Duncan’s多重比较对数据进行差异显著性分析，P＜0.01表示差异极显著；采用Origin 2021软件作图。
2结果与分析
2.1香芹酚对恶臭假单胞菌生长曲线的影响
由图1可知，空白对照组和DMSO对照组恶臭假单胞菌生长曲线十分相似，在0～6 h生长迅速。采用香芹酚处理后，恶臭假单胞菌的生长速率变缓，且随着香芹酚含量升高，其生长受到的抑制愈加明显。与2个对照组相比，香芹酚体积分数为0.005%时，恶臭假单胞菌的生长受到轻微抑制，香芹酚体积分数为0.010%时，恶臭假单胞菌生长受到明显抑制。当香芹酚体积分数≥0.015%时，其延迟期延长至16 h以上，且在16 h以后，其生长也十分缓慢。结果表明，当香芹酚在体积分数≥0.015%时对恶臭假单胞菌的生长具有良好的抑制作用。
图1不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌生长的影响
2.2香芹酚对恶臭假单胞菌泳动性和群集性的影响
由图2A可知，空白对照组和DMSO对照组的泳动性菌落较大，表明恶臭假单胞菌具有较强的运动能力。随香芹酚含量升高，恶臭假单胞菌的移动距离呈现明显减小趋势，当香芹酚体积分数≥0.010%时，对恶臭假单胞菌的泳动性有明显的抑制作用。由图2B可知，随香芹酚含量升高，恶臭假单胞菌的移动距离呈现明显减小趋势，当香芹酚体积分数≥0.015%时，对恶臭假单胞菌的群集性有明显的抑制作用。结果表明，香芹酚可明显削弱恶臭假单胞菌的运动能力，且体积分数越大，效果越好。Wang Yaying等研究香芹酚对荧光假单胞菌泳动性和群集性的影响发现，香芹酚对荧光假单胞菌的运动有很强的抑制作用，与本研究结果较为一致。
图2不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌泳动性（A）和群集性（B）的影响