PK/PD模型揭示环丙沙星对大肠杆菌突变体的时间-杀伤规律
讨论
本研究中，我们开发了环丙沙星-大肠杆菌的基于机制PK/PD模型。所开发的模型成功表征了野生型和六个大肠杆菌突变体的时间-杀灭曲线，如VPC所示（图1）。模型结构包括易感性生长细菌、静止非生长细菌和非菌落形成非生长细菌，分为两个亚群。亚群1代表易感性细菌，亚群2代表预先存在耐药细菌（图2）。描述这些数据需要这些元素，但描述完整机制将是其他旨在阐明这些关系的研究的范围。在此，观察到跨菌株的模型参数相似性，因此某些参数在菌株间共享（表2）。
在时间-杀灭数据中，观察到细菌负荷的初始下降和2-6小时之间的快速反弹，主要在约0.5×MIC浓度下。模型中通过纳入非菌落形成房室来描述这一现象，这显著改善了数据描述。可能还有其他变量影响这一点，但非菌落形成房室可满意地描述结果并得到实验支持。在估计的5.3小时后，细菌从易感性到非菌落形成房室的转移被关闭；这使得模型预测更好地描述了观察到的时间-杀灭特征。众所周知，当大肠杆菌暴露于环丙沙星时会发生丝状化。oCelloScopeTM结果指示丝状体（图4b）和流式细胞术结果（图4a）关于颗粒大小随时间的变化显示，较小细胞大小的细菌比例在4-6小时后再次增加，这加强了非菌落形成细菌与丝状体高度相关的假设。
已报道 undergo 丝状化的细菌要么死亡，要么恢复并成为可生长的"可平板接种"细胞。流式细胞术结果表明，在0.5×MIC下，丝状体在1-4小时之间形成，然后细胞恢复并开始再次复制，因为环丙沙星浓度不足以杀死丝状细菌（图4a）。对于MIC水平的浓度，观察到与0.5×MIC类似的颗粒大小增加；然而，恢复不太明显。这表明在MIC附近更多细菌被杀死，丝状体较不易恢复并开始生长。
我们的机制假设是，细菌受环丙沙星影响并形成丝状体，但不死亡。这些细菌不能完全增殖，因为它们形成丝状体，如果药物浓度不足以杀死丝状细菌，它们可能恢复并回复为模型中的易感性生长细菌。然而，应该承认，这些实验并非旨在完全表征丝状化，但纳入非菌落形成房室显著改善了环丙沙星PK/PD关系的描述。
基于机制的模型包括两个亚群，假设第二个亚群代表预先存在耐药细菌的亚群。在一些但非全部实验中，观察到实验结束时的再生长。在再生长的情况下，通过MIC测量实验支持了存在对环丙沙星易感性较低的亚群。由于关于这些预先存在耐药细菌的数据信息有限（实验并非旨在表征这些细菌），在最终模型中假设所有菌株共享该细菌群体特有的所有参数估计，包括该群体在起始接种物中的比例、kgrowth2和EC50,2。由于EC50,2被设为对所有菌株相同，S2对EC50低的细菌（即野生型）最重要，对EC50较高的突变体菌株重要性较低。此外，两个亚群的Emax无显著差异。如果起始接种量与菌株的正常突变率相比较高，则系统中存在低易感性亚群的概率很高。在此，我们估计起始接种物中每10⁶cfu/mL有0.82cfu/mL的较低易感性。预先存在耐药亚群模型结构此前已用于环丙沙星建模。Bulitta等估计了不同铜绿假单胞菌菌株经黏菌素处理的最不易感群体类似比例为每10⁶cfu/mL有0.03-0.7cfu/mL。预先存在耐药细菌的估计复制速率远低于正常复制速率，表明与耐药相关的高适应性代价。然而，由于我们的实验并非旨在表征该亚群，且估计基于少数实验和时间点，应谨慎对待。
将PK/PD模型参数与MIC相关联的概念此前已在理论层面讨论过。在我们的工作中，估计的EC50模型参数与宏量稀释法实验测定的MIC高度相关（r²=0.99）（图3）。简化的EC50/MIC相关模型使用MIC作为EC50的协变量，因此通过仅实验测定MIC，然后应用此处开发的模型结构和简化EC50/MIC相关模型的模型参数（表2），可能预测不同大肠杆菌菌株的体外时间-杀灭特征。此前已描述了大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌暴露于美罗培南、亚胺培南、头孢匹罗和头孢他啶的EC50/MIC相关性。此外，应用该相关性估计了铜绿假单胞菌经美罗培南、多立培南和亚胺培南处理的EC50，以MIC作为协变量。因此，在预测新的大肠杆菌菌株时，将在执行模拟/预测时插入MIC作为协变量，使用EC50/MIC相关模型。在预测此处研究菌株在新条件下的细菌杀灭时，例如更高的起始接种量或来自动态药物浓度系统，预期完整模型将给出最佳预测。如果指示复制速率低于此处研究的菌株，也可考虑使用较低的kgrowth以完整描述数据。
完整模型的几个EC50值之间高度（>95%）相关，LM693和LM707的EC50之间相关性最高（98%）。当所有数据同时建模且其他参数在菌株间共享时，这确实是预期的。其他参数相关性较低，估计精度合理。
我们研究的优势在于，我们检查了具有已知单重和多重耐药突变的不同特征明确菌株。我们的结果表明，所有六个大肠杆菌突变体与野生型细菌具有相似的复制速率，因为本研究数据未能估计出kgrowth的显著差异，正如Marcusson等的结果所预期，其先前已表明大肠杆菌MG1655的耐药突变通常仅产生低或无适应性代价。当允许菌株特异性复制速率常数时，kgrowth1值范围在1.58-1.71h⁻¹之间，LM707的kgrowth1值最低，但差异未达到统计学显著性。
我们的研究也有局限性。首先，我们未研究传统静态体外时间-杀灭条件之外的数据，如不同的起始接种量或动态环丙沙星浓度。其次，所研究的菌株除耐药突变外为同基因菌株，未纳入大肠杆菌临床分离株。因此，需要评估所开发的基于机制模型对不同大肠杆菌菌株（包括临床菌株）和其他实验条件的预测能力，以更好地理解其外推价值和对药物开发的用途。第三，实验并非旨在完全表征预先存在耐药亚群或非菌落形成细菌。最后，对于LM693和LM707菌株，由于产生这些数据的技术困难，我们仅研究了高达1×MIC的浓度。初始测试实验表明，在这些实验中，较高药物浓度可能产生矛盾的药物效应，即较高的药物浓度导致较低的药物效应（即细菌杀灭），可能是由于>67mg/L浓度下的溶解度问题。由于500mg口服剂量的环丙沙星Cmax约为2mg/L，未对>48mg/L的浓度进行进一步评估。
总之，我们已证明我们的模型结构可用于描述七种不同大肠杆菌MG1655菌株的时间-杀灭特征。模型参数的相似性，包括所有研究菌株的相同生长，表明此处研究的菌株主要在EC50上存在差异，而EC50与MIC相关。在经过进一步验证（例如使用临床菌株、动态浓度实验和不同起始接种量）后，该模型可能成为预测患者人群中改进给药策略的有价值工具，以有效治疗由野生型和耐药大肠杆菌引起的感染。然后，该实验和建模框架可用于寻找更有效的给药方案。
致谢
本工作的部分内容此前已在抗微生物药物与化学疗法跨学科会议和欧洲群体方法学组年会上报告。
资助
本工作由瑞典战略研究基金会支持。
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