mpc1 基因缺失对粟酒裂殖酵母有丝分裂期细胞骨架动力学的多维度影响
摘 要 细胞骨架调控线粒体的融合和分裂，同时线粒体也调控细胞骨架的正常动力学。mpc1 基因编码线粒体丙酮酸载体 1（mitochondrial pyruvate carrier 1），该蛋白位于线粒体内膜中，是线粒体丙酮酸载体复合物的重要成分。目前，尚未见相关文献报道 mpc1 基因缺失对酵母肌动蛋白等动力学的影响。本研究对粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的微管、组蛋白、肌动蛋白构建荧光标记，利用活细胞成像技术探究 mpc1 基因缺失对肌动蛋白等动力学的影响。结果表明，常温下 mpc1Δ 菌株与野生型菌株相比，纺锤体伸长时间缩短 6.70 min（P < 0.01）、伸长速率加快 0.17 μm/min（P < 0.01）；染色体分离时间缩短 3.40 min（P < 0.01）；肌动蛋白环聚集和收缩总时间延长 3.80 min（P < 0.01）。mpc1 基因缺失虽然促进了纺锤体伸长和染色体分离，但减缓了肌动蛋白环形成和收缩，最终导致细胞生长缓慢。本研究为进一步探究 mpc1 功能提供参考。
线粒体是真核细胞的能量工厂，是细胞通过氧化磷酸化和三羧酸循环途径合成 ATP 的场所。线粒体为保持其功能状态，通过不断地分裂和融合产生新的线粒体，消除旧的和受损的线粒体。
一方面，细胞骨架蛋白调控着线粒体形态和功能。Mmb1 蛋白（mitochondrial microtubule binder，线粒体微管结合蛋白 Mmb1）将线粒体和微管结合在一起，防止线粒体聚集和回缩，Mmb1 蛋白异常导致线粒体聚集且数量增加；βIII-微管蛋白及其 C 端尾部参与调节线粒体动力学和动态网状线粒体结构；Tea2 蛋白（kinesin family plus-end directed microtubule motor，驱动蛋白家族正端定向微管电机 Tea2）异常会导致线粒体碎片化且数量增加。
另一方面，线粒体蛋白也调控着细胞骨架的正常动力学。fzo1 基因（编码 Fuzzy onions protein 1，线粒体融合蛋白 Fzo1）缺失后，维管束数量增加，有丝分裂纺锤体组装异常；dnm1 基因（编码 dynamain-related protein1，线粒体分裂蛋白 Dnm1）缺失后，微管束长度增加，纺锤体伸长时间延长，染色体分离滞后；tom70 基因（编码 mitochondrial TOM complex TPR repeat subunit Tom70，线粒体 TOM 复合物 TPR 重复亚基 Tom70）缺失后，纺锤体断裂缺陷；afg1 基因（编码 AFG1 family mitochondrial ATPase，线粒体 AFG1 家族 ATP 酶）缺失后，营养生长期端粒更细长。mpc1 基因编码线粒体丙酮酸载体 1（mitochondrial pyruvate carrier 1，MPC1），该基因位于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的第 3 条染色体上，其前后基因分别为 sec6、mug146。MPC1 蛋白由 141 个氨基酸组成，分子量为 16.06 kDa（图 1）。
图 1 线粒体丙酮酸载体 1 蛋白质结构
MPC1 和 MPC2（mitochondrial pyruvate carrier 2，线粒体丙酮酸载体 2）组成线粒体内膜丙酮酸载体复合物 MPC，其具有跨膜转运蛋白活性，可以将丙酮酸从细胞质中转运到线粒体内，丙酮酸是糖类、脂质以及氨基酸的代谢中间产物。mpc1 缺失会诱导 MPC2 降解，导致 MPC 蛋白整体失活。mpc1 表达水平影响癌细胞的生存率，mpc1 表达降低促进 β-连环蛋白的核易位，从而激活 Wnt / β-连环蛋白途径，促进癌细胞的转移，而 MPC 过表达在体外抑制了癌细胞的运动。例如 mpc1 缺陷会加速肺腺癌进展，MPC1 过表达能抑制胃癌细胞。Liu 等研究发现，mpc1 基因缺失会导致细胞端粒变长。在裂殖酵母中，mpc1 缺失会导致细胞生长速度变慢，还会增加细胞对布雷菲尔丁 A、咖啡因、雷帕霉素的抗性以及对硼替佐米的敏感性。
人类 mpc1 失活会引发多种疾病，如迟发性运动障碍、乳酸性酸中毒、高丙酮酸血症、线粒体丙酮酸载体缺乏症等。酵母细胞是一种杆状单细胞真核模式生物，包括粟酒裂殖酵母、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）等，其基因组结构简单并与人类相似。其中粟酒裂殖酵母的染色体结构保守，细胞形状规则，分裂时子细胞大小和长度均匀，常用于有丝分裂及细胞周期等的研究。在裂殖酵母中，mpc1 基因缺失会导致细胞生长速度变慢，但相关分子机制尚未揭示。本研究以粟酒裂殖酵母为研究对象，在 mpc1Δ 菌株中构建荧光蛋白标记，检测 mpc1 基因缺失对纺锤体、组蛋白、肌动蛋白等动力学的影响，同时构建 mpc1 基因回补菌株进行验证，为进一步探究 MPC1 蛋白功能提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）菌株（表 1），-80 ℃冻存在西南野生动植物资源保护教育部重点实验室（本实验室）。
表 1 粟酒裂殖酵母菌株编号、基因型及来源
注：h⁻、h⁺、h 均表示菌株性别，其中 h⁻ 表示该菌株为负菌，h⁺ 表示该菌株的正菌，h？ 表示该菌株性别未知；wt 表示野生型菌株；mpc1Δ 表示 mpc1 基因缺失型菌株；GFP 为绿色荧光蛋白标记；Atb2 表示微管；Pact1-LifeAct 表示肌动蛋白；Hht2 表示组蛋白；Hygᴿ 表示潮霉素抗性；kanᴿ 表示卡那霉素抗性；URA4 表示尿嘧啶缺陷版；LEU1 表示亮氨酸缺陷版
1.1.2 培养基
YE5S 液体培养基：组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、赖氨酸各 0.11 g，葡萄糖 15.00 g，酵母提取物 2.50 g，超纯水 0.50 L；YE5S 固体培养基：在液体培养基的基础上加琼脂 8.50 g；EMM-N 产孢培养基：组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、赖氨酸各 0.11 g，葡萄糖 10.00 g，EMM-N 3.66 g，超纯水 0.50 L；YE5S + G418 (Hygᴿ) 固体筛选培养基：按照 YE5S 固体培养基配方配制并灭菌，待冷却凝固前加入 G418 (Hygᴿ)，使其浓度为 0.30 g/L；LEU1 固体筛选培养基：组氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、赖氨酸各 0.11 g，EMM-2 16.17 g，琼脂 8.50 g，超纯水 0.50 L；URA4 固体筛选培养基：组氨酸、亮氨酸、腺嘌呤、赖氨酸各 0.11 g，EMM-2 16.17 g，琼脂 8.50 g，超纯水 0.50 L。
1.1.3 主要试剂与仪器设备
葡萄糖、酵母提取物、琼脂（Thermo Fisher Scientific 公司）；巯基乙醇、腺嘌呤、赖氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、组氨酸（Sigma-Aldrich 公司）；山梨醇、乙二胺四乙酸、潮霉素（Hygᴿ）（上海麦克林生化科技有限公司）；EMM-N（生物风资源技术服务公司）；G418、甘油（广州赛国生物科技有限公司）；蜗牛酶（上海源叶生物科技有限公司）；Q5 High-Fidelity 2X MasterMix 酶（New England Biolabs 公司）；限制性核酸内切酶（BamHI）（Takara 公司）；Seamless cloning kit（北京擎科生物科技股份有限公司）。-80 ℃超低温冰箱（994，Thermo Fisher Scientific 公司）；Ⅱ级生物安全柜（MSC-Advantage，Thermo Fisher Scientific 公司）；恒温培养箱（DPX-9272B-1，Thermo Fisher Scientific 公司）；冷冻离心机（5418R，Eppendorf AG 公司）；恒温震荡器（THZ-Q，上海百典仪器设备有限公司）；微生物生长动态监测系统 oCelloScope（Biosense Solutions ApS，丹麦）；激光共聚焦倒置显微镜（TCS-SP8，Leica 公司）；正置荧光显微镜（DMI3000B，Leica 公司）；蒸汽灭菌锅（LDZX-30FA，上海申安医疗器械厂）；PCR 仪（T100，Bio-Rad Laboratories 生命科学公司）。
1.2 方法
1.2.1 mpcΔ 菌株的构建及验证
选取质粒 pFA6a-KanMX6，设计前后引物：F1 (5'-TTTTTCTGCTCCACTAATAGGATAAGCTAGTAATTTGAAGCCTTTGGCAAGCCAACCACACCTATATTATTTTTTTAAAAACGGATCCCCCGGGTTAATTAA-3')、R1 (5'-CCCTTCCTTCGAATCAATTTTGTTAGAGCAAGTGACTTATCTGTTCACTCGTATTTTAAAGAATAAATACTTGACCCTTTGAATTCGAGCTCGTTTAAAC-3')。PCR 扩增得到 Kanᴿ 基因片段，PCR 条件为 98 ℃预变性 30 s、34 个循环（98 ℃变性 10 s、63 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 2 min），72 ℃延伸 5 min，10 ℃保存。将扩增产物电泳并回收，采用醋酸锂转化法同源替换获得 mpc1Δ 菌株。
1.2.2 细胞形态的观察及生长监测
取出用甘油法保存在 -80 ℃冰箱中的野生型和 mpc1Δ 菌株，分别接种至 YE5S 固体培养基，25 ℃复苏 48 h 后，再接适量菌株至 YE5S 液体培养基，25 ℃、200 r/min 振荡培养活化 12 h（观察 37 ℃下细胞形态时，还需稀释后于 37 ℃下再活化 12 h）至菌液 OD595 在 0.5 ~ 0.8 之间时活化完成。使用正置荧光显微镜 100 倍油镜观察已活化完成的上述菌株细胞形态，截取 mpc1Δ 菌株及野生型菌株的细胞图像，测量细胞长度、纵横比、细胞面积等数据并作图分析。同时，采用丹麦 Biosense 微生物生长动态监测系统 oCelloScope 对野生型和 mpc1Δ 菌株的生长进行实时监测。将活化后的菌液按适当比例稀释后接种至 96 孔板中，每孔 200 μL，置于 oCelloScope 系统中，分别在 25 ℃和 37 ℃条件下连续监测 48 h，每 15 min 采集一次图像。通过系统内置的 BCA（Background Corrected Absorbance）算法自动获取生长曲线，并利用 SESA（Single Edge Segmentation Algorithm）算法提取单细胞形态学参数，包括细胞长度、面积和纵横比等。每个菌株设置 3 个生物学重复，每个重复 6 个技术复孔。
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