3株奥默柯达酵母生长曲线、pH耐受性、最适生长温度测定及对酱油香气和滋味影响（三）
2.2 K.ohmeri的菌种性能
2.2.1不同盐浓度下生长曲线
高盐稀态酱油发酵盐质量浓度一般≥160 g/L，而减盐发酵酱油的盐质量浓度则为100~120 g/L，为考察菌株在不同酱油生产中的生长特性，采取100 g/L和160 g/L盐质量浓度的豆芽汁培养3株K.ohmeri，结果如图4所示。3株菌在相同盐浓度下的生长曲线类似，100 g/L盐质量浓度下，3株菌对数期为16~44 h，44 h以后进入稳定期；而160 g/L盐质量浓度下，3株菌的对数期则延至36~64 h，64 h以后到达稳定期。160 g/L盐质量浓度下，3株酵母稳定期的ΔOD₅₆₀的平均值为4.135，表明其在高盐环境下生长情况良好。
2.2.2最适生长温度及pH值
温度是微生物生长的重要影响因素之一，最适生长温度有利于获得更多的发酵菌株。对3株酵母在24~40℃的生长情况进行测定，结果如图5所示。3株菌在2种盐浓度下发酵液的OD₅₆₀值随温度的升高呈现先升后降的趋势，30℃时OD值最大，因此30℃是3株菌的最适生长温度。温度升至40℃时，160 g/L盐质量浓度的条件下，3株菌发酵液OD₅₆₀值接近0，表明酵母在该条件下几乎不生长。
高盐稀态酱油酿造过程中，酱醪醪pH值一般为4~6。采用初始pH值为1~10的培养基对3株酵母生长情况进行测定，结果如图6所示。100 g/L盐质量浓度下，pH值为3~9时，3株酵母都有一定的生长能力；pH值为4~6时，生长能力最好；而在pH值为1~2及10的条件下不可生长。160 g/L盐质量浓度下，3株酵母在相同pH值条件下的OD₅₆₀值均低于100 g/L盐质量浓度，pH值为3~8时都有一定生长，其中pH值为4~6时，生长能力最好，pH值为1~2及9~10的条件下不可生长。
2.2.3高盐下产乙醇能力及挥发性风味物质代谢能力
对3株酵母160 g/L盐质量浓度下的产乙醇能力进行测定，结果如图7-a所示。3株酵母豆芽汁发酵液中的乙醇体积分数均高于0.5%，其中KD13最高，达到0.573%。进一步分析豆芽汁发酵液挥发性风味物质，发现发酵液中存在多种香气成分，其中KD13发酵液总挥发性风味物质含量最高，为（997.54±88.15）μg/L（图7-b）。综合以上K.ohmeri发酵性能特点，选用KD13进行后续的添加发酵应用。
2.3添加K.ohmeri KD13对酱油发酵的影响
2.3.1酱油的4个重要理化指标：还原糖、总酸、氨态氮、乙醇含量变化如图8所示。酱油发酵过程中还原糖含量逐渐降低，总酸含量逐渐上升，氨态氮含量在发酵后期趋于稳定。添加KD13的酱油乙醇体积分数在发酵90 d时为2.34%，较对照组提升11.4%，表明KD13具有提升酱油乙醇含量的能力。
2.3.2添加KD13对酱油挥发性风味物质的影响
为了研究添加KD13对酱油香气的影响，利用SPME-GC-MS的方法对发酵45、60、75、90 d的添加KD13和未添加KD13的2组酱油共计8个样品中的挥发性风味物质种类及含量进行分析鉴定。如表2所示，共检测到60种香气成分，其中酯类化合物12种、醇类化合物19种、醛类化合物8种、酮类化合物5种、酸类化合物5种、酚类化合物5种、杂环类化合物6种。KD13组挥发性风味物质总含量为（3912.70±253.18）μg/L，比对照组高22.18%，其中KD13组挥发性酯类物质总含量为（383.06±26.90）μg/L，比对照组高97.62%，酚类物质总含量为（201.32±10.93）μg/L，比对照组高70.18%。
以表2中60种香气成分作为因变量,不同发酵时间的2组酱油作为自变量进行OPLS-DA分析,并计算预测变量重要性投影(variable importance inprojection)。VIP值越大,因变量对样品区分度的贡献值就越大,若VIP值>1表明为关键因变量。
如图9-a所示,共筛选到23种VIP值>1的差异风味物质。其中酯类4种、醇类物质10种、酚类物质2种、醛类物质3种、其他类4种。对上述23种物质进行热图分析,由图9-b可以看出,KD13组多种香气物质含量比CK组多,其中包括酯类物质中的乳酸乙酯(奶油香)、辛酸乙酯(酒香)、乙酸异戊酯(花香)、乙酸异丁酯(花香);醇类物质中的乙醇(醇香)、正丁醇(葡萄酒香)、苯甲醇(花香);醛类物质中的苯乙醛(果香)、3-甲硫基丙醛(酱香);酚类物质中的4-乙基愈创木酚(烟熏香);杂环类物质中的2-乙基-6甲基吡嗪(可可香)、2,6-二甲基吡嗪(坚果香)、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(焦糖香)。以上分析表明,KD13不仅对酱油中乙醇含量有提升作用,同时对乙酯类等多种酱油特征风味物质有增益作用。
2.3.3添加KD13对酱油挥发性风味物质的影响
以表2中60种香气成分作为因变量，不同发酵时间的2组酱油作为自变量进行OPLS-DA分析，并计算预测变量重要性投影（variable importance in projection,VIP）。VIP值越大，因变量对样品区分度的贡献值就越大，若VIP值>1表明为关键因变量。如图9-a所示，共筛选到23种VIP值>1的差异风味物质。其中酯类4种、醇类物质10种、酚类物质2种、醛类物质3种、其他类4种。对上述23种物质进行热图分析，由图9-b可以看出，KD13组多种香气物质含量比CK组多，其中包括酯类物质中的乳酸乙酯（奶油香）、辛酸乙酯（酒香）、乙酸异戊酯（花香）、乙酸异丁酯（花香）；醇类物质中的乙醇（醇香）、正丁醇（葡萄酒香）、苯甲醇（花香）；醛类物质中的苯乙醛（果香）、3-甲硫基丙醛（酱香）；酚类物质中的4-乙基愈创木酚（烟熏香）；杂环类物质中的2-乙基-6-甲基吡嗪（可可香）、2,6-二甲基吡嗪（坚果香）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮（焦糖香）。以上分析表明，KD13不仅对酱油中乙醇含量有提升作用，同时对乙酯类等多种酱油特征风味物质有增益作用。
2.3.4感官评价分析
酱油的感官评价可以从色泽、体态、滋味、香气4个方面进行评估。对照组及KD13组酱油的感官评分结果如图10所示。2组酱油的色泽和体态评分较为接近，而KD13组滋味评分高于对照组，可能是由于酵母菌体在后酵后期发生自溶，产生呈鲜味的核酸类物质。另外KD13组的香气评分也高于对照组，这和2.3.2节的研究结果一致。感官评价结果表明，添加KD13对酱油色泽体态无负面影响，并且对酱油的滋味和香气有提升作用。
3结论
本研究从华中地区发酵3~4月的高盐稀态酱醪醪中分离筛选得到了10株K.ohmeri，10株菌均为溶血安全性菌株。对其中3株产乙醇能力较强的菌株进行菌种性能研究，发现3株菌在160 g/L盐质量浓度、温度为24~38℃、pH值4~6的环境下均生长良好，总体性能差异不大。由于在盐浓度为160 g/L的条件下，菌株KD13的乙醇及挥发性风味物质代谢能力最强，因此进一步将其添加到高盐稀态酱醪醪中发酵，发现KD13对酱油中的乙醇体积分数有提升作用，并且对酱油中多种乙酯类香气物质如乳酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯及一些酱油特征风味化合物如4-乙基愈创木酚、3-甲硫基丙醛等有增益作用。感官评价结果显示，添加KD13对酱油的色泽、体态无负面影响，对酱油的滋味和香气及总体评分有提升作用。综上所述，本研究分离筛选的耐盐K.ohmeri具有作为新型风味菌强化酱油发酵、提升风味的潜力。然而本研究中仅探究了K.ohmeri单一菌种添加发酵对酱油的影响，未来需进一步探明与其他优势风味菌的交互作用。
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