呼宁散对鸡肺源大肠杆菌生长曲线、细胞壁的影响及抑制效果——摘要
摘要
本试验旨在研究中药复方呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的抑菌活性，以及对脂多糖(LPS)诱导的鸡胚成纤维细胞(DF-1)损伤模型的抗炎和抗氧化作用。以桑白皮、黄芩、蒲公英、甘草等10味中药制备中药复方呼宁散，牛津杯法测定呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的抑菌效果，TTC法测定其最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)，绘制细菌生长曲线，检测细菌培养液中碱性磷酸酶(AKP)、核酸和可溶性蛋白的含量。CCK-8法检测LPS和呼宁散对DF-1细胞的毒性，建立LPS诱导的DF-1细胞损伤模型并给药，ELISA法测定炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8的含量，Western blot法测定TLR4/NF-κB信号通路中Toll样受体4(TLR4)和核因子-κB p65(NF-κB p65)关键蛋白表达量，相关试剂盒测定细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性，Western blot法测定Keap1/Nrf2信号通路中Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)和核因子E2相关因子2(Nrf2)关键蛋白表达量。结果显示：鸡肺源大肠杆菌对呼宁散呈中度敏感，且MIC为250 mg·mL-1，MBC为500 mg·mL-1；呼宁散可抑制鸡肺源大肠杆菌的生长，提高细菌培养液中AKP、可溶性蛋白和核酸含量。在细胞试验中，呼宁散可降低LPS诱导的DF-1细胞上清液中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量，抑制TLR4、NF-κB p65蛋白的过度表达；呼宁散可降低LPS诱导的DF-1细胞ROS和MDA的含量，提高SOD活性和GSH含量，进一步提高Nrf2、NQO1、HO-1蛋白的表达量，抑制Keap1蛋白的过度表达。中药复方呼宁散对鸡肺源大肠杆菌具有良好的抑菌活性，并且可通过调控TLR4/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路关键蛋白的表达对LPS诱导的DF-1细胞损伤发挥抗炎和抗氧化作用。
随着现代畜牧业规模化的发展，高密度的饲养条件使鸡更易受到多种病原体感染，造成鸡呼吸道疾病频发。鸡呼吸道疾病综合征又称多因素呼吸道病，主要由细菌、病毒、支原体这三大类病原体出现两种及以上混合感染所致。临床表现主要以呼吸道症状为主，如呼吸异常、咳嗽和流鼻涕等，伴有腹泻等其它症状。大肠杆菌作为感染率最高的呼吸道细菌性病原体，发病率较高，通常由呼吸道开始入侵，损害气管及肺部，极易与其他的病原体混合感染引起鸡呼吸道疾病综合征，严重危害鸡生长性能，甚至导致死亡，给鸡养殖业造成了巨大经济损失。因此，控制大肠杆菌感染对于防控鸡呼吸道疾病综合征具有十分重要的意义。目前，兽医临床多采用抗生素治疗大肠杆菌感染，然而抗生素的滥用或不合理使用使得大肠杆菌耐药增强，而且抗生素残留也对动物源性食品安全和人类健康造成了严重的威胁。作为世界第一养殖大国，我国正踏上畜牧业绿色发展与健康产业密切结合的进程，中药的应用为养殖端减抗产品的研发开辟了一条新的路径。
中药具有来源丰富、毒副作用小等优势，日益受到国内外畜牧兽医工作者的广泛关注。研究表明，多种中药提取物及中药复方对于大肠杆菌感染具有显著疗效。中兽医药讲究辨证论治，鸡大肠杆菌感染可辨为湿热证，细菌侵袭机体引发的鸡呼吸道疾病综合征在中兽医归于“上感”范畴。外邪入侵，湿热滞凝，致使肺气不宣，喉痒咳嗽，治疗原则主要是润肺益气、抗菌消炎、清热解毒、增强机体免疫力。
本研究依据辩证施治基本原则，在《中国兽药典》记载的药材中进行筛选，根据“君臣佐使”原则进行合理组方并命名为“呼宁散”：其中，桑白皮为君药主攻肺疾，泻肺平喘、清肺降火、润肺益气；黄芩等臣药起止咳作用，抗菌消炎以辅助君药加强药效；蒲公英等佐药具有清热解毒、增强免疫之功效；甘草等使药负责调和诸药，和中缓急，缓解药物毒性、烈性，补脾益气。实验室前期已研究表明该方在10 g·kg-1及以下剂量无毒性作用，安全性好。为明确呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的抑菌活性及体外抗炎、抗氧化作用，本研究以呼宁散为试验药物，通过抑菌试验及体外细胞试验进行探讨，给临床用于防治鸡呼吸道疾病综合征的药物研发提供理论依据，促进禽类养殖业的绿色健康发展。