末水条斑紫菜调节肠道菌群结构并促进有益代谢产物丁酸生成
[目的]本文旨在探究末水条斑紫菜对健康C57BL/6J小鼠肠道微生物及其代谢产物的影响。[方法]对小鼠分别灌胃生理盐水(对照组)、1.15 g·kg-1(低剂量组)和2.30 g·kg-1(高剂量组)剂量的末水条斑紫菜,28 d后取小鼠标本进行病理切片观察、短链脂肪酸含量测定以及肠道菌群16S rDNA高通量测序。[结果]灌胃末水条斑紫菜组小鼠生长性能没有显著性变化。与对照组结肠长度53.50 mm相比,低剂量组小鼠结肠显著增长至65.60 mm;结肠组织病理切片显示,末水条斑紫菜可以增加杯状细胞的数量。通过对结肠内容物中短链脂肪酸含量测定,发现乙酸、丙酸、正戊酸与异戊酸含量均没有显著变化,低剂量组小鼠结肠内容物中正丁酸含量显著增加,高剂量组小鼠结肠内容物中正丁酸与异丁酸含量均显著增加。经16S rDNA高通量测序小鼠结肠内容物发现,灌胃低剂量与高剂量末水条斑紫菜均可降低微生物物种多样性,增加厚壁菌门的相对丰度,降低拟杆菌门的相对丰度。但肠道中杜氏杆菌属(Dobusiella)相对占比显著增加,Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014、螺杆菌(Helicobacter)等致病菌相对占比减少。[结论]末水条斑紫菜能够促进结肠组织长度变化,调节健康C57BL/6J小鼠肠道菌群,促进有益菌生长以及丁酸的产生,最佳摄入量为1.15 g·kg-1。
引言
条斑紫菜(Porphyra yezoensis)是属于红藻纲红毛菜科的一种藻类,是我国大型经济海藻之一。条斑紫菜多在我国长江以北的江苏和山东等沿海地区栽培,其采收期一般在10月至次年的2月下旬。条斑紫菜的采收期依据时间顺序,通常被划分为4～5个采收阶段,分别命名为头水、二水、三水、四水以及末水条斑紫菜。随着采收期的推迟,条斑紫菜的口感与市场价值急剧下降。但是,有研究发现末水条斑紫菜中蛋白质与膳食纤维含量较头水条斑紫菜有显著提升。Goñi等通过体外消化模拟试验发现,紫菜中的蛋白质在胃肠道内的消化率明显超过其他藻类,而在消化残渣中接种大鼠粪便发酵后发现,紫菜中可发酵蛋白质的含量显著低于其他藻类,这可能会降低紫菜在结肠发酵过程中生成有害代谢产物的风险。Sakai等发现紫菜中的藻红蛋白能够通过抑制肥大细胞脱颗粒在体内表现出抗炎活性。Ulagesan等发现从紫菜中纯化的重组铁蛋白对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均有抑菌活性。此外,紫菜中丰富的可溶性膳食纤维能够有效增加肠道蠕动,促进有害物质排出体外,还能作为肠道菌群发酵底物从而促进肠道菌群生长。除了上述的蛋白质和膳食纤维,紫菜中的活性多糖也被证实对人体胃肠道具有益处。Wang等通过研究不同采收期的紫菜多糖功能活性发现,末水紫菜中的多糖抑制肠上皮细胞的过敏活性,且随着采收期的推迟,其功能活性逐渐增强。迄今,对于紫菜的研究大多集中在对其功能活性成分上,而紫菜原料对肠道健康及肠道微生物的菌群结构影响的研究较少。
肠道是人体重要的消化器官,人类的微生物群中有80%的微生物在肠道中被发现。在人体健康和体内微生态平衡中,肠道菌群的复杂性和多样性都发挥了重要作用。而饮食是决定肠道微生物群结构的最关键因素之一,也是最易于干预的因素。每一种主要的宏量营养素和许多微量营养物质都被证明可以改变肠道微生物群。其中,以膳食碳水化合物的作用最为显著。Hu等发现膳食纤维与肠道中发酵膳食纤维的菌种呈正反馈。Shen等研究发现高膳食纤维饮食能够改善Ⅱ型糖尿病患者肠道菌群结构,增加乳酸杆菌与双歧杆菌等有益菌丰度,降低脱硫菌等致病菌的丰度。相比于动物源蛋白质,植物源蛋白质能够通过改善肠道微生态从而影响机体的脂质代谢。被称为“第七营养素”的多酚可以通过抑制致病菌和促进有益菌的生长来调节人体肠道微生物群。末水条斑紫菜富含蛋白质、膳食纤维、多糖、多酚等营养素,但末水条斑紫菜在调节肠道微生物群方面的作用报道较少。由于试验小鼠与人类基因同源性高达78.5%,且培育出的小鼠个体差异小、数量充足,因此选用健康C57BL/6J小鼠进行本次试验。
本研究选用健康C57BL/6J小鼠,分别灌胃不同剂量的末水条斑紫菜,记录试验期间小鼠生长性能的变化,28 d后观察小鼠结肠组织形态及病理切片,通过对结肠内容物的短链脂肪酸含量测定以及肠道菌群高通量测序,比较末水条斑紫菜对小鼠肠道菌群结构及其代谢产物含量的变化,从而探讨其对肠道健康的作用,为末水条斑紫菜的开发利用提供理论支撑。
1材料与方法
1.1材料与仪器
无特定病原体(SPF)级C57BL/6J雄性小鼠(6～8周龄),体重20～23 g,购于浙江维通利华实验动物技术有限公司桐乡分公司[许可证号:SCXK(浙)2020-0002]。末水条斑紫菜(蛋白质26.89%,总糖50.98%,脂肪1.90%,灰分8.14%),2021年3月由江苏省连云港(紫菜)推广示范基地提供。HE染色液套装购自皮诺飞生物科技有限公司;色谱纯乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、4-乙基丁酸均购自上海麦克林生化科技有限公司;E.Z.N.A.Soil DNA Kit DNA抽提试剂盒购自美国Omega公司。
RM2016型病理切片机购自LEICA公司;JB-L5型冻台购自武汉俊杰电子有限公司;KD-P型组织摊片机购自浙江省金华市科迪设备有限公司;E100型生物显微镜和ECLIPSE-Ci型拍照显微镜购自NIKON公司;Pannoramic SCANⅡ型扫描仪购自济南丹吉尔电子有限公司;Illumina PE300/PE250测序平台购自美国Illumina公司;Agilent 8860型气相色谱仪购自美国安捷伦公司;DW-HL38型超低温冰箱购自安徽合肥中科美菱低温科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1动物的饲养分组及灌胃剂量
参照中国营养学会推荐人体每天摄入碘的限量,根据紫菜中碘的含量换算,人体每天最多摄入紫菜15 g左右。根据徐叔云教授主编的《药理实验方法学》中的人与动物剂量换算,本试验选择1.15、2.30 g·kg-1的剂量进行灌胃试验。小鼠的灌胃容量一般为每10 g体重0.10～0.30 mL,选择每只0.50 mL的灌胃量。
30只C57BL/6J雄性小鼠,分笼饲养于南京农业大学动物实验中心[许可证号:SYXK-(苏)-2011-0036],饲养环境温度(24±2)℃,相对湿度(50±5)%,12 h昼、夜节律。日常维持饲料由南京农业大学动物实验中心提供。本次动物试验已获得南京农业大学实验动物伦理审查委员会批准(NJAU.No2023518085),所有的相关操作均按照动物实验标准规范。试验开始前,小鼠需提前适应环境7 d。按初始体重随机将小鼠分为3组,每组10只,分别为对照组(无菌生理盐水)、低剂量组(0.046 g·mL-1紫菜粉末悬浊液)、高剂量组(0.092 g·mL-1紫菜粉末悬浊液),连续28 d每天灌胃1次。饲养期间自由饮食饮水并记录,每3 d称量记录小鼠的体重,试验结束后计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)及平均日增重(average daily gain,ADG)。ADFI(g·d-1)=每组小鼠试验期内采食量/试验天数;ADG(g·d-1)=每组小鼠试验期内增重/试验天数。
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