3株奥默柯达酵母生长曲线、pH耐受性、最适生长温度测定及对酱油香气和滋味影响（一）
摘要
柯达酵母属为华中地区酱醪醪优势菌属，为探究其对高盐稀态酱油风味和品质的影响，从酱醪醪中共分离鉴定共得到10株奥默柯达酵母，且10株酵母均无溶血性。筛选其中3株乙醇积累能力较强的菌株K02、KD13和KD28，对其生长曲线、pH耐受性、最适生长温度进行研究。3株菌在160g/L盐质量浓度、pH值为4~6、温度为30℃的条件下生长良好。进一步将高盐下乙醇及挥发性风味物质代谢能力最强的菌株KD13在酱油酿造中进行添加发酵应用，理化指标分析显示，KD13对酱油的还原糖、总酸、氨态氮含量影响不大，乙醇含量较对照样提升了11.4%。利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术分析检出60种挥发性风味物质，添加KD13发酵的酱油中挥发性风味物质总含量较对照组提升22.18%。利用正交偏最小二乘法判别分析筛选出添加酱油及对照样中变量投影重要性分析值大于1的差异风味物质共计23种，差异风味物质随时间变化的热图分析显示，KD13对酱油中乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇以及4-乙基愈创木酚、3-甲硫基丙醛等酱油特征风味物质有明显提升作用。感官评价分析表明，奥默柯达酵母对酱油香气和滋味有增益作用。该研究为奥默柯达酵母在酱油酿造中的应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
发酵3~4月的高盐稀态酱醪醪和成品曲，取自华中地区某酱油厂。
酵母基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；酵母26S rDNA PCR试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；2-甲基-3-庚酮（内标物），德国Dr.Ehrenstorfer公司；其他药品试剂，国药集团化学试剂有限公司。
溶血性试验菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），由湖南省调味品发酵工程技术研究中心保藏。
培养基（g/L）：100、160 NaCl的豆芽汁培养基，100、160 NaCl的YPD培养基，脱纤维羊血培养基均参考文献配制。
1.2仪器与设备
E200型显微成像系统，尼康映像仪器（上海）有限公司；PE28型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；722型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；VERITI型梯度PCR扩增仪，美国应用生物有限公司；DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂；Champ Gel 5000 Plus型凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18型色谱柱，安捷伦科技（中国）有限公司；436GC/EVOQ TQ/PAL型气质联用仪，美国Bruker Daltonics公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取针，美国Supelco公司；DB-5MS型色谱柱，美国Agilent公司。
1.3实验方法
1.3.1生香酵母的筛选
发酵3~4月的高盐稀态酱醪醪梯度稀释后，涂布于含有100 g/L NaCl的豆芽汁固体平板上，30℃培养48~72 h，根据形态挑取酵母单菌落，稀释纯化3次，获得纯培养菌株，接种至豆芽汁培养基，30℃培养72 h，进行香气嗅闻。
1.3.2生香酵母的鉴定
采用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母模板DNA，PCR扩增，采用20μL体系：模板DNA 1μL，酵母通用引物NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3'）和NL-4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）各2μL，Taq聚合酶0.5μL，MgCl₂溶液1μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP 0.5μL，dd H₂O补足至20μL。PCR循环参数：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃末端延伸7 min，4℃保存。扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，结果登录NCBI进行同源性比对，构建系统发育树。
1.3.3 K.ohmeri产乙醇能力测定
调整种子液浓度为10⁸CFU/mL，以1%（体积分数）接种量接种至豆芽汁培养基，培养7 d，测定乙醇含量。筛选产乙醇能力最高的3株K.ohmeri进行后续的发酵性能研究。
1.3.4 K.ohmeri溶血性实验
脱纤维羊血培养基冷却至50℃时添加5%的脱纤维羊血，摇匀后倒入无菌平板冷却备用。将活化菌无菌操作在平板上划S形曲线，阳性对照菌培养条件为37℃、24 h，测试菌及阴性对照菌培养条件为30℃、48 h。
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