鸽源大肠杆菌分离株对13种抗菌药物耐药现状研究（二）
1.4耐药基因检测
•菌株DNA模板的制备:参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌分离株DNA，于-20℃条件下保存备用。
•引物设计与合成:根据参考文献设计16种E.coli耐药基因引物，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：
•喹诺酮类:
◦qnrS:F:5'-ACGACATTCGTCAACTGCAA-3',R:5'-TAAATTGGCACCCTGTAGGC-3',片段长度417 bp,退火温度55℃
◦oqxA:F:5'-GATCAGTCAGTGGGATAGTTT-3',R:5'-TACTCGGCGTTAACTGATTA-3',片段长度670 bp,退火温度55℃
•β-内酰胺类:
◦blaTEM:F:5'-CAGCGGTAAGATCCTTGAGA-3',R:5'-ACTCCCCGTCGTGTAGATAA-3',片段长度734 bp,退火温度54℃
◦blaSHV:F:5'-TTATCTCCCTGTTAGCCACC-3',R:5'-GATTTGCTGATTTCGCTCGG-3',片段长度860 bp,退火温度57℃
◦blaCTX-M:F:5'-CGCTTTGCGATGTGCAG-3',R:5'-ACCGCGATATCGTTGGT-3',片段长度550 bp,退火温度54℃
◦blaNDM:F:5'-GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3',R:5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3',片段长度621 bp,退火温度52℃
◦blaIMP:F:5'-GGAATAGAGTGGCTTAAYTCTC-3',R:5'-CGGAATGGCTCATCACGATC-3',片段长度332 bp,退火温度52℃
◦blaMIR:F:5'-TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG-3',R:5'-CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT-3',片段长度302 bp,退火温度64℃
◦blaVIM:F:5'-GATGGTGTTTGGTCGCATA-3',R:5'-CGAATGCGCAGCACCAG-3',片段长度390 bp,退火温度52℃
◦blaDHA:F:5'-AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT-3',R:5'-CCGTACGCATACTGGCTTTGC-3',片段长度405 bp,退火温度64℃
•氨基糖苷类:
◦aacC2:F:5'-ACTGTGATGGGATACGCGTC-3',R:5'-CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA-3',片段长度482 bp,退火温度58℃
◦aacC4:F:5'-CTTCAGGATGGCAAGTTGGT-3',R:5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCAT-3',片段长度286 bp,退火温度58℃
•磺胺类:
◦sul1:F:5'-CTTCGATGAGAGCCGGCGGC-3',R:5'-GCAAGGCGGAAACCCGCGCC-3',片段长度238 bp,退火温度58℃
◦sul2:F:5'-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3',R:5'-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3',片段长度722 bp,退火温度50℃
•多黏菌素类:
◦mcr-1:F:5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3',R:5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3',片段长度309 bp,退火温度55℃
◦mcr-2:F:5'-TGTTGCTTGTGCCGATTGGA-3',R:5'-AGATGGTATTGTTGGTTGCTG-3',片段长度567 bp,退火温度65℃
•耐药基因PCR扩增:以提取的DNA为模板进行耐药基因的检测。反应体系(25.0μL)为:2xFast Taq plus PCR Master 12.5μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 9.5μL。反应条件为:95℃预变性5 min;94℃变性30s，表1中相应退火温度退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸10 min。反应完成后，取5.0μL PCR扩增产物置1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，于凝胶成像系统中拍照。
2结果(Results)
2.1细菌的分离与鉴定
在麦康凯琼脂培养基上共分离纯化出150株疑似大肠杆菌的单菌落，可见边缘整齐、表面光滑湿润、中间隆起的红色圆形菌落（描述如下）。
疑似菌株经MALDI TOF MS质谱仪分析共鉴定出120株大肠杆菌。
2.2耐药表型检测
120株大肠杆菌分离株对13种抗菌药物的药敏试验结果如下：
•MIC分布和敏感性总结:
•环丙沙星(CIP):敏感率17.50%(21/120),耐药率65.00%(78/120),中介率17.50%(21/120)
•氨苄西林(AMP):敏感率45.83%(55/120),耐药率54.17%(65/120)
•阿莫西林克拉维酸(AMC):敏感率53.33%(64/120),耐药率46.67%(56/120)
•头孢噻肟(CTX):敏感率51.67%(62/120),耐药率35.00%(42/120),中介率13.33%(16/120)
•头孢他啶(CAZ):敏感率44.17%(53/120),耐药率30.00%(36/120),中介率25.83%(31/120)
•亚胺培南(IPM):敏感率52.50%(63/120),耐药率15.83%(19/120),中介率31.67%(38/120)
•阿米卡星(AMI):敏感率78.33%(94/120),耐药率15.83%(19/120),中介率5.83%(7/120)
•庆大霉素(GEN):敏感率50.83%(61/120),耐药率30.83%(37/120),中介率18.33%(22/120)
•甲氧苄啶(TMP):敏感率52.50%(63/120),耐药率32.50%(39/120),中介率15.00%(18/120)
•磺胺甲噁唑(SMZ):敏感率46.67%(56/120),耐药率44.17%(53/120),中介率9.17%(11/120)
•黏菌素(CL):敏感率78.33%(94/120),耐药率21.67%(26/120)
•氯霉素(CHL):敏感率71.67%(86/120),耐药率28.33%(34/120)
•磷霉素(FOS):敏感率92.50%(111/120),耐药率7.50%(9/120)
通过对大肠杆菌分离株的多重耐药情况分析发现，共有74株(占分离株61.67%)对3种及以上抗菌药物耐药，最多可以对8种抗菌药物耐药，其中对4种抗菌药物耐药的菌株数量最多，有27株(占分离株22.50%)。多重耐药结果基于表3内容总结如下：
•多重耐药菌株分布:
•耐3种药物菌株:20株
•耐4种药物菌株:27株
•耐5种药物菌株:17株
•耐6种药物菌株:7株
•耐7种药物菌株:2株
•耐8种药物菌株:1株
描述多重耐药占比的图片嵌入如下。
2.3耐药基因检测
120株大肠杆菌分离株的耐药基因检测统计结果如下：
•耐药基因检出率:
•qnrS:91.7%(110/120)
•oqxA:0(0/120)
•aacC2:0(0/120)
•aacC4:27.5%(33/120)
•sul1:2.1%(25/120)
•sul2:0(0/120)
•mcr-1:0(0/120)
•mcr-2:0(0/120)
•blaTEM:87.5%(105/120)
•blaSHV:0(0/120)
•blaCTX-M:30.8%(37/120)
•blaNDM:0(0/120)
•blaIMP:0(0/120)
•blaMIR:0(0/120)
•blaVIM:3.3%(4/120)
•blaDHA:0(0/120)
2.4耐药表型和耐药基因型分析
由耐药表型和基因型检测结果可知，大肠杆菌分离株对β-内酰胺类抗菌药物AMP、AMC、CTX、CAZ和IPM的耐药率为15.83%-54.17%，与其耐药基因检出率结果3.3%-87.5%基本相符，尤其是对CTX的耐药率(35.00%)与头孢噻肟酶CTX-M的基因blaCTX-M检出率(30.8%)一致；对氨基糖苷类抗菌药物AMI、GEN的耐药率为15.83%-30.83%，与其耐药基因检出率结果27.5%基本一致；对喹诺酮类抗菌药物CIP的耐药率为65.00%，低于其耐药基因检出率91.7%；对磺胺类抗菌药物TMP、SMZ的耐药率为32.50%-44.17%，高于其耐药基因检出率2.1%；CL耐药率同样高于其耐药基因检出率。
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