生食大眼金枪鱼中生物胺产生菌分离纯化、菌落总数、生长曲线及形状鉴定（一）
摘要：为了探究大眼金枪鱼(Thunnus obesus)生鱼片中生物胺产生菌的产胺特性,从市售大眼金枪鱼生鱼片中分离出9株生物胺产生菌的单菌落并确定其生长曲线,采用高效液相色谱法分析了菌株发酵液中生物胺的浓度。结果表明,9株菌株为嗜温菌,适宜环境下均可产生色胺、腐胺和尸胺。筛选出3株生物胺产量较高的菌株,通过单菌落接种于TSB培养基培养,3 d累积产生生物胺的质量浓度分别为40.4、41.3和50.3 mg/L。将产胺量较高的菌株进行VITEK 2和16S r DNA鉴定,3株菌株分别为溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus),产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。该研究结果为进一步研究如何抑制大眼金枪鱼中生物胺的产生提供了理论依据,也为大眼金枪鱼的保藏研究奠定了理论基础。
大眼金枪鱼(Thunnusobesus)又称肥壮金枪鱼，属鲈形目鲭科，大洋性洄游鱼类，分布于印度洋、大西洋、太平洋和南海外海等地。其肉质鲜美，营养丰富，不仅富含蛋白质，还含有DHA和EPA等不饱和脂肪酸，食用和商用价值极高。据最新国际渔业动态报道，随着金枪鱼市场价格不断走高，捕捞量也在大幅提高。
目前，国内市售大眼金枪鱼占有市场比例较高，由于其属于红肉鱼类，在加工和流通过程当中，如果加工和贮藏不当，容易造成生物胺超标。生物胺是一种低分子量的碱性含氮化合物，广泛存在于蛋白质及氨基酸含量丰富的水产品中，主要通过微生物产生的氨基酸脱羧酶分解游离氨基酸产生。食用生物胺超标水产品，易引起人体中毒，近些年来因食用金枪鱼而发生的生物胺中毒事件时有发生。国内对于生食金枪鱼已经有了相关标准，其中组胺不得超过90 mg/kg。
国内外对水产品中生物胺产生菌已经有了相关研究，常见的有弧菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、乳酸菌、肠杆菌等，除此之外一些新的菌群也被证实可产生生物胺，如沙门菌群、巴斯德菌和根瘤菌等不同菌科。目前，大眼金枪鱼中生物胺产生菌的相关研究鲜有报道。本文将大眼金枪鱼的生鱼片作为研究对象，通过微生物分离结合高效液相色谱技术，筛选出了生物胺产生菌，再利用表型特征鉴定和基因型鉴定相结合的方法，确定了菌株的种类，以期为生食大眼金枪鱼肉中生物胺的控制提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大眼金枪鱼，购于广州市沛洋食品有限公司(-60℃冻藏)。
腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、酪胺、丹磺酰氯(纯度≥98%)，美国Sigma公司；NaCl、NaOH、NaHCO3、NH3·H2O，广州粤升化学试剂厂；胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂、L-组氨酸、色氨酸、酪氨酸、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptose soya agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth，TSB)，广州市普博仪器有限公司；乙睛(色谱纯)，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水，实验室自制。
1.2仪器与设备
LC-20AD高效液相色谱仪，日本岛津SHINADZU公司；CX41显微镜，日本OLYMPUS公司；MILLI-Q超纯水机，美国Millipore公司；3K30高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；SPX-500智能生化培养箱，宁波江南仪器厂；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；TU-1990紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；oCelloScope微生物生长监测系统，法国梅里埃公司；DYY-7B电泳仪，北京六一仪器厂。
1.3实验方法
1.3.1样品制备
将金枪鱼在无菌环境下解冻后置于0℃下贮藏备用。
1.3.2菌落总数和K值的测定
参考GB4789.2—2016的方法，测定0℃贮藏的大眼金枪鱼中的菌落总数。
参考SC/T 3048—2014的方法，测定0℃贮藏的大眼金枪鱼中K值变化。K值计算如公式(1)所示：
式中：ATP为腺苷三磷酸浓度、ADP为腺苷二磷酸浓度、AMP为腺苷酸浓度、IMP为肌苷酸浓度、HxR为次黄嘌呤核苷浓度、Hx为次黄嘌呤浓度，单位均为μmol/g。
1.3.3培养基配制
生物胺筛选培养基(g/L)：胰蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、琼脂20、溴甲酚紫0.06、L-组氨酸2、色氨酸2、酪氨酸2，1 mol/L HCl调pH至5.3±0.2。
TSA培养基(g/L)：取47 g TSA于1 L蒸馏水中灭菌，制成平板培养基和斜面培养基。
TSB培养基：取TSB 3 g、L-组氨酸0.03 g、色氨酸0.03 g、酪氨酸0.03 g于100 mL蒸馏水中灭菌。
相关新闻推荐
1、A型塞内卡病毒全长感染性克隆、致病机理及生长曲线分析（一）