KLK5过表达促进宫颈癌移植瘤生长曲线并降低顺铂化疗敏感性的实验研究（三）
2结果
2.1宫颈癌ME180细胞中KLK5蛋白表达水平
与ME180-NC-KLK5细胞比较，ME180-OE-KLK5细胞中KLK5蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图1。
图1 Western blotting法检测宫颈癌细胞中KLK5蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）
2.2各组裸鼠体质量和一般情况
皮下移植瘤种植后第1周，各组裸鼠进食和活动状态良好，体质量逐渐增长。第2周开始进入给药阶段，药物治疗期间NC-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠进食和活动状态及体质量较第1周无明显变化；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠开始出现食欲减退，体质量不增，活动状态减弱。第3周药物治疗期间，NC-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠进食及活动状态较第2周无明显变化，开始出现体质量不增长；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠进食减退，活动状态减弱，体质量降低。见图2。
图2各组裸鼠体质量折线图
2.3各组裸鼠皮下移植瘤大体表现和体积
治疗结束后处死裸鼠并剥离瘤体，拍照记录，计算肿瘤体积并绘制瘤体生长折线图。结果显示：与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组移植瘤体积明显减小（P<0.01）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组移植瘤体积明显增大（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤体积增大（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3和4。
图3各组裸鼠移植瘤大体表现
图4不同时间点各组裸鼠移植瘤体积
2.4各组裸鼠移植瘤质量
与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤质量降低（P<0.05）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠瘤质量明显降低（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠瘤质量升高（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠瘤质量差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。
图5各组裸鼠皮下移植瘤质量
2.5各组裸鼠皮下移植瘤组织病理形态表现
与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤细胞核异质性更强；OE-KLK5+DDP组和NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤细胞出现细胞形态学改变，表现为细胞核固缩、碎裂，肿瘤细胞体积缩小以及出现坏死和凋亡等；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤坏死程度更明显。见图6。
图6各组裸鼠肿瘤组织病理形态表现（HE）
2.6各组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平
KLK5阳性染色表达定位于细胞质，呈现棕黄色或褐色颗粒时为阳性表达；Ki67阳性染色表达定位于细胞核，出现棕黄色或褐色颗粒时为阳性表达；MMP-9阳性染色表达定位于细胞膜和细胞质，当出现棕黄色或褐色颗粒时为阳性表达。各组裸鼠肿瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达趋势基本一致。与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平降低（P<0.05）；与NC-KLK5+DDP组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平升高（P<0.001）；与NC-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9表达水平升高（P<0.001）；与OE-KLK5+0.9%NaCl组比较，OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤组织中KLK5、Ki67和MMP-9蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。
3讨论
宫颈癌是全球女性主要死亡原因之一，放化疗是晚期宫颈癌的重要治疗手段，部分患者预后不良。研究表明：KLK5在女性生殖系统恶性肿瘤中表达上调，且与肿瘤的进展和不良预后有关。在子宫内膜癌中，KLK5过表达患者的临床病理类型侵袭性更强，是预后的不良因素。KLK5过表达与卵巢癌患者不良临床结局有关联，且患者血清中KLK5浓度升高，提示KLK5可作为卵巢癌的潜在生物标志物，用于卵巢癌的早期诊断和预后评估。SUK等分析165例接受根治性放疗的宫颈癌患者，发现KLK5过表达患者发病年龄更小、主动脉旁淋巴结更易受累、5年局部无复发生存率和无远处转移生存率更低，从而证实了KLK5过表达与宫颈癌的侵袭性有关。ZHOU等发现KLK5过表达与放疗后的不良预后有关联，并通过体内和体外实验证实了KLK5过表达可增加辐射抗性，而下调KLK5表达可增加放疗敏感性。
本研究结果显示：OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠皮下移植瘤体积和重量均大于NC-KLK5+0.9%NaCl组，表明KLK5过表达能促进宫颈癌细胞在裸鼠体内的生长。此外，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠肿瘤组织中Ki67和MMP-9表达水平高于NC-KLK5+0.9%NaCl组。Ki67的表达贯穿细胞增殖的全过程，通过极其复杂的方式与遗传物质及其他蛋白质结合，是核糖体合成的必需因子，其表达水平可反映细胞的增殖活跃程度，是评估细胞增殖的标志物。Ki67表达水平越高，提示组织异质性越高，进而导致病情转归恶化。MMP是锌依赖性蛋白水解酶，对细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分有降解作用，而细胞和ECM成分间的相互作用对癌症进展至关重要。MMP-9是MMP家族的重要成员，其在多种恶性肿瘤中过表达，是宫颈癌独立的不良预后因素。MMP-9通过促进ECM蛋白降解以调节ECM重构，使细胞和基底膜相连的Ⅳ型胶原纤维破裂，促进肿瘤细胞发生上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增强肿瘤细胞侵袭及转移能力。本研究通过免疫组织化学染色法检测各组肿瘤组织中Ki67和MMP-9蛋白表达水平，结果证实KLK5过表达上调了与宫颈癌增殖和侵袭相关蛋白Ki67及MMP-9表达，证明KLK5过表达增强宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力。
本研究结果显示：OE-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积和质量与OE-KLK5+0.9%NaCl组差异不明显，而NC-KLK5+DDP组裸鼠移植瘤体积和质量小于NC-KLK5+0.9%NaCl组。此外，OE-KLK5+0.9%NaCl组裸鼠肿瘤组织中Ki67和MMP-9表达水平仍高于NC-KLK5+0.9%NaCl，表明KLK5过表达可能通过维持较高的Ki67和MMP-9表达来降低移植瘤对DDP的敏感性，表明KLK5过表达可能削弱DDP的化疗效果，导致化疗对肿瘤的生长抑制作用减弱。
本研究通过建立宫颈癌OE-KLK5细胞皮下移植瘤裸鼠模型，探讨KLK5过表达对皮下移植瘤生长及化疗敏感性的影响，结果显示：KLK5过表达能促进宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的生长，并降低移植瘤对DDP的敏感性，同时上调与宫颈癌增殖和侵袭相关蛋白Ki67及MMP-9的表达，证实KLK5过表达促进了经DDP给药的宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的生长，同时抑制了化疗诱导的凋亡坏死，降低了宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的化疗敏感性，为宫颈癌的临床治疗提供了新思路。KLK5可能作为宫颈癌诊断和预后评估的潜在标志物，预测宫颈癌患者对化疗的敏感性，以期在将来的临床治疗中指导KLK5不同表达情况的宫颈癌患者进行化疗的必要性及DDP用药选择方案，从而改善患者的生存率和生存质量。
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