牛奶酶处理对口腔细菌群落组成影响的16S rRNA扩增子测序分析
2.5 使用oCelloScope进行细菌生长试验
使用oCelloScope（BioSense Solutions，丹麦）评估XO和LPO对细菌生长的影响。将过夜细菌培养物稀释至初始细胞密度为10⁴ CFU mL⁻¹，基于600 nm处光密度（OD₆₀₀）。将XO和LPO加入培养基中，与细菌悬液一起加入96孔板，最终浓度范围为40–200 μg mL⁻¹，每处理三个重复。还包括未处理的对照。使用oCelloScope光学筛选系统监测细菌生长24小时，该系统允许对细菌生长进行自动化、实时、活细胞成像分析，具有高灵敏度。oCelloScope置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，每15分钟扫描每孔两次。分析时选择背景校正吸收算法。生成细菌生长曲线，并确定每个时间点的平均增长量。计算每种条件下最大五次平均增长的平均值以评估抗菌效果。
2.6 乳组分对细菌组成和基因表达的影响
通过DNA测序调查LPO以及LPO与XO联合对细菌组成的影响。此外，通过RNA测序分析LPO与XO联合对基因表达的影响，并与对照进行比较。将过夜细菌培养物稀释至初始细胞密度为10⁶ CFU mL⁻¹。将细菌悬液和稀释的乳酶（80 μg mL⁻¹）加入锥形瓶中，最终体积为15 mL。还包括仅含培养基的对照。将锥形瓶于37 °C和180 RPM下孵育，约4小时后测量每瓶的OD₆₀₀。收获用于DNA测序的细菌悬液，样品储存于−80 °C。对于RNA测序，将细菌悬液于4 °C下以5000×g离心5分钟，沉淀在液氮中速冻后储存于−80 °C。
2.7 DNA提取
对于DNA提取，使用OD₆₀₀值在0.75至1.5之间的0.5 mL细菌培养物作为每个条件的样品材料。使用DNeasy PowerLyzer PowerSoil试剂盒（Qiagen，德国）按照制造商建议提取总基因组DNA。使用Qubit 1× dsDNA HS检测试剂盒（Invitrogen，美国）在Qubit 4荧光计（Invitrogen，美国）上定量DNA，并储存于−20 °C直至使用。
2.8 16S rRNA基因的纳米孔测序
为评估细菌群落组成，使用正向引物27F 5'-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3'和反向引物1392R 5'-GACGGGCGGTGWGTRCA-3'扩增16S rRNA基因的V1-V8区域。PCR扩增以25 μL重复进行，含PCRBIO 1× Ultra Mix（PCR BIOSYSTEMS，美国）、400 nM每种引物和10 ng提取的DNA。PCR条件如下：95 °C初始变性2分钟，随后35个循环：95 °C 15秒、55 °C 15秒、72 °C 90秒，最后72 °C延伸5分钟。扩增子生成的质量控制包括使用阳性和阴性对照。
使用CleanNGS（CleanNA，荷兰）以1:0.8的样品:磁珠比例纯化扩增子，并用25 μL无核酸酶水洗脱。对纯化样品进行定量，并使用Agilent 4150 TapeStation与ScreenTape D5000（Agilent Technologies，美国）评估选定样品的尺寸。随后对PCR产物进行条形码标记并等摩尔混合。混合文库进行DNA修复、末端修复、接头连接、纯化，并将60 fmol加载到PromethION R10.4.1流动池上，使用SQK-LSK114与EXP-PBC096，按照制造商建议（Oxford Nanopore Technologies，英国）操作。文库测序6小时。
2.9 扩增子测序数据的预处理
原始读段使用Dorado v.0.6.0与sup v.4.3.0进行碱基识别和解复用，在MinKNOW软件中使用标准设置，要求两端均存在条形码。使用ONT-AmpSeq流程进行扩增子预处理，Q值阈值≥23，保留1200 bp至1600 bp之间的读段，并使用MiDAS 4作为参考数据库。以97%的相似性进行聚类。
2.10 RNA提取和纯化
RNA测序样品收集四个生物学重复。使用改良版RNeasy Mini试剂盒（Qiagen，德国）从沉淀中提取总RNA。将沉淀用含β-巯基乙醇（1% v/v）的Buffer RLT重悬。将相当于约10⁹个细胞的悬液体积从每个样品转移至RNeasy PowerMicrobiome试剂盒（Qiagen，德国）的Power Beads管中，使用FastPrep-24匀浆器（MP Biomedicals，美国）以4 m/s进行60秒的珠磨步骤。从此步骤开始，按照制造商建议进行总RNA提取。使用riboPOOL cleanUP模块（siTOOLs Biotech，德国）按照制造商建议纯化RNA，并用40 μL无核酸酶水洗脱。使用Qubit RNA BR检测试剂盒（Invitrogen，美国）在Qubit 4荧光计上定量总RNA，并使用RNA ScreenTape（Agilent Technologies，美国）通过生物分析仪测定RIN值评估RNA质量。在整个总RNA提取和纯化过程中，样品置于冷藏块中以防止RNA降解，除非另有说明。
2.11 cDNA文库制备和测序
纯化的总RNA样品使用大肠杆菌多聚(A)聚合酶进行加尾。对于每个样品，反应混合物含约6 μg总RNA、1 mM ATP（最终浓度）、1×大肠杆菌多聚(A)聚合酶反应缓冲液和5 U大肠杆菌多聚(A)聚合酶（NEB，英国），于37 °C孵育30分钟。使用riboPOOL cleanUP模块按照制造商建议纯化总RNA。使用riboPOOL探针方案（siTOOLs Biotech，德国）按照制造商建议去除rRNA。使用生物分析仪按照第2.10节所述验证rRNA去除成功。使用Direct cDNA Sequencing V14试剂盒与SQK-LSK114（Oxford Nanopore Technologies，英国）进行cDNA合成和文库制备，使用SuperScript IV反转录酶（Thermo Fisher Scientific，美国），按照制造商建议操作。使用Native Barcoding Kit 24 V14（Oxford Nanopore Technologies，英国）进行接头连接和条形码标记。将约100 fmol制备好的条形码标记和接头连接的文库加载到PromethION R10.4.1流动池上，文库测序72小时。
2.12 RNA测序数据的处理和分析
原始读段使用Dorado v.0.7.2与sup v.4.3.0进行碱基识别和解复用，不去除条形码但要求两端均存在条形码。使用Pychopper v.2.7.9识别和修剪含链切换引物和VN引物的全长cDNA读段。使用Cutadapt v.4.6从全长cDNA读段中修剪多聚(A)尾。将修剪后的全长cDNA读段使用minimap2 v.2.26映射到最丰富生物体的RefSeq基因组。然后使用gffread v.0.12.7从这些基因组提取的转录本重新映射读段。使用Oarfish v.0.4.0进行转录本定量。使用DESeq2 v.1.44.0进行差异基因表达分析。进一步使用EggNOG v.4.5.1进行基因本体论富集分析。
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